基于非病毒载体的mRNA疫苗递送系统研究进展

左青婷 熊文碧

（1. 四川大学华西药学院，四川 成都 610041；2. 四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室，四川 成都 610041）

1 mRNA疫苗

mRNA疫苗的概念起源于1989年，Vical公司成功将外源性mRNA装载进脂质体纳米粒中并转染入真核细胞[1]。随后的一系列研究进一步证明外源性mRNA可以递送入活体组织中并产生蛋白质，可治疗性用于病人的蛋白质错误或缺失[2]。除此之外，在二十世纪九十年代初，有研究表示mRNA可以递送抗原信息引发机体的免疫反应[3]。在随后的30年研究中，mRNA疫苗已经到达了一个新的高度，许多候选药物具有肿瘤治疗和感染性疾病防治的应用前景，已经进入临床试验。目前的mRNA疫苗主要包括非复制型（Non-replicating）mRNA疫苗和自我扩增型（Self-amplifying） mRNA疫苗。

1.1 非复制型mRNA疫苗

非复制型mRNA疫苗通过线性pDNA或PCR模板的体外转录合成，主要结构包括5'帽子结构（Cap）、5'非翻译区（Untranslated region，UTR）、开放阅读框（Open reading frame，ORF）、3'非翻译区和多聚腺苷酸尾巴〔Poly（A）〕。5'-UTR和3'-UTR中的调节元件可以调控mRNA的翻译过程。ORF是含有编码蛋白质的核酸序列。5`帽子可以防止mRNA被外切酶迅速降解；防止天然免疫传感器的识别；与真核翻译启动因子结合[4]。Poly(A)尾巴通过多聚腺苷酸结合蛋白（Poly A binding protein，PABP）连接帽子和尾巴，增强mRNA的稳定性[5]。

1.2 自我扩增型mRNA疫苗

自我扩增型mRNA是将编码抗原的核酸序列直接插入单链RNA病毒中，其中编码mRNA复制机制的基因是完整的，只是编码结构蛋白的基因被目的基因替换[6]。和非复制性mRNA相比，自我扩增型mRNA有两个优势：自我复制能力使目标抗原在宿主细胞中高水平表达；mRNA表达时间增长，如非免疫源性报告蛋白可以在体内持续两个月的表达[7]。

mRNA疫苗相比于DNA疫苗更加安全，不会导致治疗性基因整合突变，并且能成功激活体内的免疫应答。此外，一种新的mRNA结构通常可以以一种直接、快速的方式合成，这一特点使mRNA疫苗在面对传染性疾病如流感时成为理想的候选药物。但是，为了保证mRNA疫苗在体内的稳定性与安全性，还需要合适的载体材料。mRNA疫苗的载体材料分为病毒载体和非病毒载体。本综述主要讨论用于递送mRNA的非病毒载体的种类及研究进展。

2 递送mRNA疫苗的非病毒载体材料

2.1 阳离子脂质

脂质体是由单层或多层磷脂双分子组成的球形囊泡，囊泡内为含有靶基因的水性核心。通常使用含有极性头部基团和非极性尾部的材料制备，这些基团之间的疏水和亲水相互作用刺激囊泡形成。带正电的阳离子脂质可以与带负电的mRNA相互作用，从而达到递送目的。但由于早期使用的阳离子脂质在生理条件下也带正电，既容易与生物流体中其他带负电的分子相互作用，又容易被免疫细胞捕获。因此，PH响应的阳离子脂质被筛选出，并被制备成多种形式的mRNA的递送载体。

脂质纳米粒（Lipid nanoparticle，LNP）是其中研究较多、较成熟的一种。LNP是由脂质形成的、具有双分子层结构的封闭囊泡。组成脂质双层壳的材料有可电离脂质、磷脂、胆固醇、聚乙二醇化脂质，每种脂质都发挥着不同的功能。含有胺基的脂质或类脂类，如Dlin-MC3-DMA、G0-C14、C12-200是可电离脂质，有着合适的pKa，在较低的PH条件下带正电，在生理条件下呈中性，这样既减少了非特异性脂质与蛋白质的相互作用，又可帮助mRNA实现内涵体逃逸。组成LNP的磷脂（二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱），胆固醇，聚乙二醇（PEG）化脂质（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-PEG）则有提高双层膜的稳定性，促进细胞内摄取等作用。

正电中心的结构、尾巴的长度、尾巴的几何结构以及连接链的长度等都会影响到LNP的效价。Anderson[8]等通过烯基环氧化合物与多胺核之间的开环反应合成具有烯基氨基醇类的可电离脂质（OF-00、OF-01、OF-02、OF-03）。脂质与胆固醇、1,2-二醇基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、C14-PEG-2000以及未修饰的编码人红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）的mRNA配制成LNP，以cKK-E12[9]为阳性对照，进行转染效率的比较。OF-02 LNPs的EPO血清浓度远高于cKK-E12 LNPs的EPO血清浓度。此外，在进行量效曲线对比时，OF-02 LNPs优于cKK-E12 LNPs，前者在2.25 mg•kg-1剂量时达到了最大EPO浓度25400±5300 ng·ml-1。cKK-E12和OF-02的正电中心均为双赖氨酸衍生的二酮哌嗪，区别在于前者的尾巴为氨基醇类脂质，后者连接的是碳十六二烯烃。除此之外，适当增加连接链长度、加入载脂蛋白E等也能提高mRNA的转染效率[10]。

除了脂质纳米粒外，阳离子脂质还会被制备成阳离子纳米乳（Cationic nanoemulsion，CNE）用于提高mRNA疫苗在体内的稳定性。Brito[11]的研究团队使用阳离子脂质（2, 3-二油酰基-丙基）-三甲胺和乳液佐剂MF59制备阳离子纳米乳。该CNE在小鼠体内递送编码呼吸道合胞病毒融合糖蛋白的mRNA，在新西兰白兔体内递送编码HIV gp140包膜糖蛋白的mRNA，在非人类灵长动物体内递送编码人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的mRNA。这些mRNA在体内都表现出良好的免疫原性。

2.2 多聚物

自1987年多聚赖氨酸（Polylysine，PLL）被报道作为首个阳离子多聚物非病毒载体成功转染质粒DNA后，精胺、聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚胺基脂等多聚物类非病毒载体相继问世。

聚氨基脂〔Poly(b-amino)ester，PBAE〕是一类聚胺类阳离子聚合物，通常由两步反应生成。第一步为胺与二丙烯酸酯通过迈克尔加成聚合，第二步用二元胺进行末端封闭。核心胺除了亲水性胺类，也会有亲脂性胺类，比如C12烷基胺，以提高PBAE的稳定性和转染效率。PBAE的可降解性、高转染效率和合成路径简单使PBAE十分具有前景，在早期被成功用于DNA的体内外转染[12]。随后研究人员对PBAE进行修饰，成功在体内完成mRNA的递送。Anderson[13-14]等人以7mol%聚乙二醇-脂质（PEG-lipid）修饰PBAE，提高其在体外的血清稳定性，并通过静脉注射成功将mRNA递送到小鼠的肺中。转染效率高的PBAE甚者超过了商业使用的jetPEI的体内转染效率。需要注意的是，PEG-lipid修饰与体外血清稳定性和转染效率并非完全呈正相关，优化程度取决于原PBAE的化学结构，并且体外血清稳定性并不是唯一的指标，它更适合作为疗效筛选后的二级标准。随后的两年，Anderson[15]等人再次用聚己内酯（Polycaprolactone，PCL）修饰PBAE，完成了mRNA到脾脏的高效递送，打开了用生物可降解载体递送编码抗原的mRNA的可能性。研究人员对传统二丙烯酸酯进行改造或对聚氨基脂进行整体修饰，使PBAE更多功能化、更低毒性、更高效。

聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）也是一种非常有前景的阳离子多聚物递送载体，最初作为非病毒载体递送DNA进入小鼠大脑[16]。PEI丰富的仲胺、叔胺基团在一定PH条件下呈正电性，具有高密度电荷和缓冲能力。同时，以上特有的理化性质让PEI有独特的方式保护核酸免于溶酶体降解[17]。虽然PEI作为基因递送载体有其独特的优势，但其严重的细胞毒性限制了应用。随着PEI分子量的增加，虽然转染效率提高，但毒性也随之增大。为了克服限制，研究人员对PEI进行了各种结构的改造与修饰，如用多糖、聚乙二醇修饰PEI以提高生物相容性和转染效率，用阴离子脂质体或中性脂质体包裹PEI/核酸聚合物，可以减少聚合物的非特异性粘附。此外，研究人员还通过制备低分子量PEI衍生物，在保证其低细胞毒性的同时提高转染效率。

2.3 树形分子及其衍生物

聚酰胺-胺（Polyamidoamine，PAMAM）和聚丙烯亚胺（Polypropyleneimine，PPI）是研究最广泛的两类树形分子。在结构上，树形分子一般具有规整的分子结构，高度支化的分子内有许多空腔，末端含有丰富的官能团。Chahal[18]等人开发一个快速反应，完全合成，单一剂量，无需佐剂的树状大分子纳米粒子疫苗平台，以更好应对突发疫情，持续发展的病原体以及特殊需求的病人。可电离的树状大分子纳米材料结合上PEG修饰的脂质，最后包封mRNA复制子得到疫苗。疫苗通过肌内注射可以检测到相应RNA的成功表达以及抗原特定T细胞的激活。在另一份报道中，Siegwart[19]等人从可以有效递送siRNA/miRNA到肝脏的树状大分子脂质纳米粒（Dendrimer lipid nanoparticle，DLNP）中得到灵感，设计出一种优化的DLNP，用于递送编码延胡索酸水解酶的mRNA。使用优化的DLNP，在低剂量mRNA下，>44%的肝细胞可以被转染并且高产延胡索二酰乙酰乙酸水解酶蛋白。

2.4 细胞穿透肽

细胞穿透肽（Cell-penetrating peptide，CPP）发现于1988年，是一种短序列多肽，能帮助细胞摄取多种分子。Frankel和Pabo的研究[20]表明HIV-1的反转录激活因子（Trans-activator of transcription，Tat）能进入组织培养中的细胞，并最终定位于细胞核；1990年Prochiantz[21]等人根据果蝇同源异型触角基因的序列合成了有60个氨基酸的多肽（pAntp）。该多肽不仅可以进入哺乳动物神经细胞促进神经元分化，还可以增强已分化神经细胞的形态转变。虽然CPP的跨膜机制仍不清楚，但人工合成设计CPP的大门已经开启。CPP具有低毒性和无细胞限制的优势，已被用于成功递送寡肽、蛋白质、pDNA等。

目前，CPP在mRNA递送领域的研究相对较少，但依旧具有较大潜力。Koker[22]研究团队设计了一种具有双亲性RALA基序的CPP，可以将编码抗原的mRNA递送到免疫系统。在酸性条件下，该细胞穿透肽带有低密度正电荷，双亲性的RALA基序也帮助包裹mRNA进入胞浆，编码抗原，促进CD8 T细胞分化。此外，该研究团队还尝试将修饰的mRNA（假尿苷和5-甲基胞苷修饰的mRNA）与CPP联合。修饰后的mRNA在促进T细胞分化方面得到提升，并且这种优化只发生在CPP介导的载体，并不发生在以脂质为基础的载体。

2.5 其他

最近，Wang[23]等以聚乙二醇-聚乙丙交酯嵌段聚合物为主要原料，辅以阳离子脂质BHEMChol，制备阳离子脂质-聚合物杂化纳米颗粒（Cationic lipid-assisted nanoparticle，CLAN）。CLAN能将Cas9 mRNA和引导RNA（guide RNA，gRNA）递送入巨噬细胞，用于治疗NLRP3依赖的炎症性疾病。Hammond[24]等人通过将多聚腺苷酸结合蛋白（Poly A binding protein，PABP）与mRNA协同组装以提高mRNA在小鼠体内的表达。

3 结语

相比于传统疫苗，mRNA疫苗可应对多种新型病毒，甚至癌症。为了将mRNA疫苗更好地应用于临床，研究人员聚焦于增强mRNA疫苗的稳定性、降低其免疫原性、优化和完善其递送系统。以往的递送载体开发进程慢，现在研究人员会利用计算机，采用可控的开环反应、平行合成等方法在短时间内合成大量递送载体，再通过有效的筛选技术得到转染效率高的递送载体，大大节约了时间和成本[25]。但目前实现了从实验室到临床试验的mRNA疫苗只有一小部分。递送载体的稳定性、细胞毒性、包封率等问题还有待解决。为了研发出符合药品生产质量管理规范要求、能最终应用于临床的mRNA疫苗，基因递送材料尤其是非病毒递送材料领域仍待更深的开拓。