外泌体在骨肿瘤中的研究进展

马东营, 孙 浩, 王永祥

(1. 扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225009;2. 扬州大学临床医学院, 江苏省苏北人民医院 骨科, 江苏 扬州, 225001)

恶性肿瘤已成为全球范围内第2大死亡原因[1]。恶性肿瘤远处转移是癌症死亡的最常见原因[2]。骨恶性肿瘤约占总恶性肿瘤的1%, 虽然所占比例小，但是治疗难度很大。骨恶性肿瘤具有独特的解剖学、生理病理学特征，可促进癌症转移，尤其是实体瘤，包括前列腺癌、乳腺癌、肾脏癌和肺癌的癌转移[3]。首先，骨肿瘤细胞本身具有从原发灶向远处骨骼组织迁移的能力，这些都与肿瘤异质性有关; 其次，骨骼系统的解剖特征是独特的，如红骨髓允许肿瘤细胞进入血液并保留在骨髓组织内[4]; 再次，受影响的骨骼和肿瘤细胞引起各种生物学反应，包括与小梁骨和基质细胞结合的肿瘤细胞产生的黏附分子; 最后，肿瘤细胞进一步产生血管生成因子和骨吸收因子[5]。骨肿瘤患者5年生存率显著降低，并导致一系列的并发症，包括严重的骨痛、病理性骨折、高钙血症和脊髓压迫，严重影响患者的生存质量与预期寿命。癌细胞扩散与骨微环境的高度特异性相互作用决定了这样的结果。近年来研究[6]发现，外泌体的活动在骨肿瘤细胞与其微环境的信息传递过程中发挥了重要作用，骨肿瘤细胞分泌的外泌体(即肿瘤外泌体)成分特殊，可以用作肿瘤检测的生物标记物。此外，外泌体独特的结构也使其适用于靶向药物传递系统的构建，有助于实现抗肿瘤药物的靶向传递。

1 外泌体的形成及生物学特点

胞外囊泡是一种小体积的膜状囊泡，按照产生机制和直径的不同，可以分为3类，即微囊泡、外泌体和凋亡小体。外泌体为多形性的囊泡样小体，可由各类细胞分泌，发源于细胞内吞系统中的晚期内体或多囊泡内体，直径在30～150 nm, 形成过程复杂。质膜向内凹陷、出芽形成早期内体，早期内体出芽包裹细胞内容物，形成多腔小囊泡的晚期内体，这种包括多腔小囊泡的晚期内体称之为多泡体，一部分多泡体在溶酶体及自噬体中降解，另一部分晚期内体在依赖性内体蛋白分选转运复合体或非依赖性内体蛋白分选转运复合体、微管蛋白、细胞骨架蛋白、Rab27、ATP等参与下与细胞膜融合后通过胞吐方式释放到细胞外，形成外泌体[7-9]。外泌体内容物主要包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、蛋白质及脂类[10]。体内几乎所有细胞包括肿瘤细胞都可产生外泌体，其广泛存在于尿液、血液、胸腹腔积液、唾液、胆汁、精液等体液中[11-13]。研究[14]表明，肿瘤细胞产生的外泌体膜上的整合素，对肿瘤具有定向运输作用。肿瘤细胞外泌体的靶向分泌，使肿瘤细胞与周围组织细胞实现定向物质和信息交流，有利于肿瘤微环境的形成和肿瘤细胞的远处播散、免疫逃逸及耐药。

2 外泌体与骨肿瘤

2.1 外泌体与骨肿瘤的早期诊断

外泌体在体液中稳定存在，能抵抗各种酶体，可通过各种生物屏障，可安全地携带多种活性分子并呈递给靶细胞，可作为肿瘤理想的生物标志物[15]。不同肿瘤细胞所释放的外泌体往往携带不同的表面蛋白，将骨肿瘤患者体液中的外泌体进行分离后，利用基因组学和蛋白质组学等高通量检测手段，可明确体液中肿瘤性外泌体和正常人群的表达差异及特征性蛋白，对于疾病诊断及预后评估具有重要的临床价值。血液中外泌体内miR-25-3p水平可以作为骨肉瘤患者预后的诊断指标，与患者术后是否发生远处转移存在显著相关性。外泌体除了在骨肉瘤中发挥着重要作用以外，在尤文肉瘤的发生、发展中也可能有着重要作用[16]。Miller等[17]首次在Ewing肉瘤细胞系中证明外泌体的存在，并且外泌体中同时检测到Ewing肉瘤较为特异的融合基因EWS-FLI1的表达。

2.2 外泌体与骨肿瘤微环境

肿瘤微环境主要由5大成分构成，包括成纤维细胞、内皮细胞、癌症干细胞、骨髓细胞和相关的可溶性细胞因子等[18]。外泌体参与了肿瘤局部微环境的调节与构成，影响了肿瘤的生长及发展[19]。Corrado等[20]研究发现，人多发性骨髓瘤细胞释放的外泌体被骨髓基质细胞(BMSCs)摄取，引起BMSCs中的白细胞介素-8(IL-8)mRNA及其蛋白的高表达，高表达的IL-8增强了骨髓瘤细胞在单层骨髓基质细胞上的黏附能力，说明多发性骨髓瘤细胞所分泌的外泌体可为肿瘤的发生、发展提供必要条件。另外，多发性骨髓瘤细胞分泌的外泌体可通过降低自噬基因BAD、BAX和PUMA的表达，提高抗自噬基因BCLXL、BCL-W和BIRC5的表达，从而提高骨髓瘤细胞的生存能力[21]。Cui等[22]研究报道，小鼠胚胎成骨前体细胞分泌多种Wnt/β-catenin信号通路，这些通路在成骨分化过程中激活骨髓间充质干细胞(BMSCs)和与成骨相关的miRNA。外泌体上调了成骨相关基因的表达并促进了矿化结节的形成。上述研究表明，这些miRNA可以通过外来体转移至效应细胞，并发挥基因调控功能。

2.3 外泌体与骨肿瘤侵袭、转移

外泌体内携带有多种活性调节分子，其稳定存在于体液之中，沿着外周血循环、旁分泌或自分泌定植远处器官，促使癌细胞发生定向转移。Garimella等[23]研究证明，高度侵袭性和转移性骨肉瘤的143B细胞主要通过钙离子通道载体和腺苷酸环化酶激活剂来主动调节细胞内钙或环状单磷酸腺苷(cAMP)水平而产生外泌体，从而增加细胞内钙或cAMP水平。Raimondo等[24]研究发现，双调蛋白(AREG)在多发性骨髓瘤样品的外泌体中特别富集，而外泌体衍生的AREG导致破骨细胞中表皮生长因子受体配体(EGFR)的激活，参与多发性骨髓瘤诱导的破骨细胞形成。上述研究结果表明，外泌体是多发性骨髓瘤细胞与骨髓微环境联系的重要介质。骨转移在前列腺癌(PCa)患者中很常见, Karlsson等[25]研究报道，从PCa细胞中分离出的外泌体显著延缓了单核破骨细胞前体向成熟和多核破骨细胞的融合和分化。肿瘤细胞衍生的外泌体也明显降低了已建立的破骨细胞融合和分化标志物的表达，包括树突细胞特异性跨膜蛋白、跨膜AMPAR调节蛋白、组织蛋白酶K。

整合素是外泌体上的重要调节分子，由α、β亚基构成，而亚基配比不同，对不同脏器的作用也不一样。Hoshino等[26]研究发现，肿瘤细胞产生的外泌体上的整合素与转移前生态位的形成(PMN)有关，并且所有的外泌体都可表达α2β1, 根据其构成比不同，可转移至不同脏器。这些外泌体上整合素与转移灶上的细胞融合形成定向转移位态。因此，靶向外泌体的整合素蛋白可能影响了癌症转移。

肿瘤的复发、转移是临床上常见的现象之一，也是患者死亡的重要原因。外泌体对肿瘤细胞侵袭、转移有重要的调节作用，因此研究外泌体调节肿瘤复发、侵袭、转移的机制对临床工作有重要的指导作用。

2.4 外泌体与骨肿瘤的免疫

肿瘤细胞分泌的外泌体可通过传递TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、Fas配体(FasL)等诱导自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞凋亡，有利于肿瘤细胞逃离免疫监视。巨噬细胞以细胞接触依赖性方式将特异性内源性miRNA转移至肝癌细胞中，通过影响蛋白质表达，抑制肿瘤细胞增殖[27]。Troyer等[28]研究发现，骨肉瘤源性外泌体可以通过降低CD4+和CD8+T细胞增殖、细胞活性和促进免疫抑制相关细胞因子转化生长因子-β(TGF-β)、甲胎蛋白(α-fetoprotein)、热休克蛋白的表达来影响机体免疫功能，从而实现骨肉瘤细胞的免疫逃逸。Chen G等[29]研究发现，转移性黑色素瘤释放的外泌体在其表面携带程序性死亡受体1(PD-L1), 应用干扰素-γ刺激可增加外泌体上PD-L1表达量，从而抑制了CD8T细胞的功能并促进肿瘤生长。研究[30]表明，肿瘤来源的外泌体介导肿瘤免疫应答的抑制，通过诱导活化CD8T细胞的凋亡和干扰自然杀伤细胞的活化，促进肿瘤逃逸。

3 外泌体与骨肿瘤治疗

外泌体在外周血及体液中稳定存在，不易被体内各种免疫细胞吞噬、清理，具备作为靶向药物和靶向基因治疗载体的特性。Torreggiani等[31]研究发现，阿霉素耐药骨肿瘤细胞(MG63)释放的外泌体可被转运至非耐药细胞，并诱导后者产生阿霉素耐药表型，这一现象可能与多耐药基因-1(MDR-1)mRNA和P-糖蛋白(P-glycoprotein)的转运相关。Shedden等[32]利用荧光标记抗肿瘤药物，发现外泌体可将其由胞内排出至胞外，在一定程度上解释了肿瘤化疗的耐药性。Xu J F等[33]通过对746种miRNA的筛选，发现骨肿瘤低化疗敏感性患者的血清外泌体中有12种miRNA(miR-135b、miR-148a、miR-27a及miR-9等)明显上调和18种miRNA(miR-124、miR-133a、miR-199a-3p及miR-385等)明显下调，可能的机制涉及肿瘤蛋白多糖代谢、Hippo信号转导通路、转录失调、磷脂酰肌醇3-激酶-Akt信号转导通路、Ras信号转导通路、泛素介导的蛋白水解及胆碱代谢等。膜联蛋白(annexin2)、Smad2、甲硫腺苷磷酸化酶、骨架调节蛋白CIP4、色素上皮衍生因子等相关mRNA异常表达与患者低化疗敏感性密切相关。随着外泌体参与MDR机制的逐渐阐明，外泌体检测将成为预测和监测骨肿瘤、患者化疗效果的重要参考依据，同时利用外泌体增强患者对化疗药物的敏感性可能为骨肿瘤化疗指出新的方向。

4 展 望

外泌体在骨肿瘤的发生、发展中发挥着双重作用，既具有促进作用，又具有抑制作用，即能产生耐药，又能调节药物敏感性。外泌体携带多种活性分子，直接或间接地参与细胞间的信息交流，影响周围细胞的病理生理过程。稳定存在的外泌体可作为良好的生物标志物，对骨肿瘤的早期特异性的诊断及治疗具有重大意义。此外，外泌体还可作为生物载体发挥治疗剂作用。