基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在肿瘤诊断及微生物鉴定中的应用

管明秀，张文成，王宝占，崔 喆，陈宝颖，张 霞

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是目前临床诊断中一项创新技术，因其具有操作简单、快速、高灵敏度、高特异性等优点，越来越多地被临床实验室认可， 已成为精准医学不可缺少的分子诊断技术。血清肿瘤标志物可早期筛查无症状癌症患者，已经成为近年来蛋白质组学关注的热点之一，对于癌症患者的早期筛查、早期诊断、早期治疗，以及预测癌症患者的预后具有不可估量的重要价值。

1 MALDI-TOF MS 在癌症诊断中的应用

传统的2D 凝胶电泳技术操作复杂，耗时费力，重复性差，对于小分子的低丰度蛋白的分离效果不好［1］，不适用于临床诊断。 MALDI-TOF MS 与磁珠技术联合可以筛选出血清低分子量蛋白/多肽，建立癌症蛋白标志物的指纹图谱诊断预测模型［2，3］。

1.1 MALDI-TOF MS 在食管癌诊断中的应用食管癌是发生于食管上皮组织的恶性肿瘤，是临床上比较常见的消化道肿瘤。 全世界每年大约有30多万人死于食管癌［4］。我国是食管癌高发地区，病死率仅次于胃癌。 罹患食管癌的患者中，大约有80%是食管鳞状细胞癌 （esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）。 食管癌早期症状不明显，70%的患者发现时，已经处于晚期［5］。

张婷等［6］研究发现，利用弱阳离子交换磁珠（WCX-MB）提取血清蛋白/多肽后，经MALDI-TOF MS 检测59 例食管鳞癌患者及57 例健康体检者血清，可以筛选出差异表达蛋白/肽，从而构建了食管癌诊断预测模型。 该研究通过磁珠联合MALDITOF MS 技术，运用遗传算法（GA），监督神经网络算法（SNN）以及快速分类算法（QC）建立了三种食管癌诊断预测模型，准确性分别为93.1%、89.7%和89.7%。 其中运用GA 建立的模型诊断效能最佳，特异性和敏感性分别为93.3%和92.9%。 该研究对食管癌诊断的敏感性远高于Nakamura 等［7］研究证明食管癌的血清肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）的诊断敏感性为12.5%；细胞角蛋白19 片段（CYFRA21-1）的诊断敏感性 33.9%。 张等［6］研究还发现食管鳞癌组多肽峰m/z 2660.84 和m/z 5336.49 表达上调，两个峰的AUCROC 值分别为0.95 和0.91， 较比健康对照组具有显著性差异。

通过MALDI-TOF MS 建立的食管癌诊断预测模型，具有较高的敏感性和特异度，适用于食管鳞癌高危人群的筛查和辅助诊断。 多肽峰m/z 2660.84 和m/z 5336.49 有望成为新食管鳞癌诊断标志物。

1.2 MALDI-TOF MS 在胃癌诊断中的应用 胃癌是来自胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤。 全球每年胃癌的发病率约100 万［8］，我国的胃癌发病率占全球的50%以上［9］。在我国的癌症统计数据中，胃癌的发病率位列第 2，病死率位居第 3 位［10］。目前胃癌的早期诊断存在很大的局限性［11］，糖类抗原CA19-9、糖类抗原CA72-4、CEA 等血清肿瘤标志物诊断胃癌的敏感性和特异性比较低［12］。目前MALDI-TOF MS联合磁珠技术进行低丰度蛋白/肽检测的蛋白质组学研究成为关注的热点［13］。

王娜娜等［14］利用 WCX-MB 联合 MALDI-TOF MS 检测60 例胃癌患者和60 例健康体检者的血清，建立了相应蛋白表达指纹图谱，筛选出差异表达蛋白/肽峰m/z 2952.57 和m/z 5904.36，两个峰的AUCROC值分别为0.93 和0.81。运用GA 建立了胃癌诊断预测模型，该模型诊断灵敏度为93.3%，特异性为 90.0%。 YANG 等［15］利用 MALDI-TOF MS 检测70 例胃癌患者和健康体检者的血清，筛选出差异表达蛋白/肽峰m/z 5335.08 和m/z 1546.02，这与王娜娜等［14］筛选出的多肽峰具有相似性。 LIU 等［16］对 28例胃癌患者和16 例健康体检者进行血清检测，筛选出差异表达蛋白/肽峰m/z 5904.83。 以上进一步说明MALDI-TOF MS 检测的可靠性。 WCX-MB 联合MALDI-TOF MS 技术具有操作简单、灵敏度高、快速等优点， 适用于临床诊断。 m/z 5904.36，m/z 5335.08 和m/z 5904.83 有望成为诊断胃癌的血清标志物。

1.3 MALDI-TOF MS 在甲状腺微小结节良恶性诊断中的应用 中国抗癌协会于2016年发布了首个《甲状腺微小乳头状癌诊断与治疗专家共识》，认为甲状腺微小乳头状癌经手术治疗可根除，5年生存率能够达到98.5%［17］，部分患者发生远处转移、淋巴结转移和肿瘤复发［18］，因此，对于甲状腺微小结节的早期良恶性鉴别、合理规范治疗，以及后期随访都有着重大的意义。 因甲状腺微小结节体积小，超声检查误诊率高，诊断符合率仅为78.8%［19］，超声引导下的细针穿刺虽然有比较高的敏感性和特异性， 但是也有因诊断可疑或取材不满意而延误诊断的情况发生［20］。 磁珠联合 MALDI-TOF MS 能够捕获小分子蛋白/多肽，詹宇红等［21］通过磁珠联合MALDI-TOF MS 技术， 对65 例甲状腺微小恶性结节和50 例微小良性结节进行血清检测， 筛选出差异蛋白峰 m/z 3320.19、m/z 8127.39、m/z 4302.35，构建了甲状腺微小恶性结节诊断预测模型。 盲法监测该诊断预测模型的敏感性为80%， 特异度为86.7%， 高于超声检查诊断［20］。 与卢秀波等［22］用MALDI-TOF MS 建立的甲状腺恶性结节的诊断模型的敏感度88.0%，特异度83.0%具有一致性。 m/z 3320.19、m/z 8127.39、m/z 4302.35 有望成为甲状腺微小恶性结节的诊断血清标志物。

2 MALDI-TOF MS 在微生物鉴定中的应用

近年来MALDI-TOF MS 在微生物鉴定领域表现出了独特的优势。 较比微生物鉴定传统的检测方法检测周期长， 不能满足临床诊疗时效性的需要，尤其是针对菌血症等重症感染的患者，MALDI-TOF MS 可以直接使用临床样本， 或经过分离培养出单菌落进行检测，获得蛋白质谱图，与微生物数据库参考图谱进行比对，进行菌属、菌种的鉴定，缩短了鉴定时间［23，24］。 与传统检测微生物表型和生理生化反应的方法相比，MALDI-TOF MS 具有快速、准确、高通量和低成本的优势［25，26］。 现将 MALDI-TOF MS在微生物领域鉴定中的应用阐述如下。

2.1 细菌 最近研究证明，MALDI-TOF MS 在细菌鉴定方面具有显著的优势，除了常见细菌［27，28］，还能 鉴定 出厌 氧菌［29］、分 枝杆 菌［30］等。 MALDI-TOF MS 对细菌进行鉴定的主要是依据对细菌生物标志物的分子量及分子结构进行测定来完成。 细菌的生物标志物包括蛋白质、核酸和脂类［31］。 由于细菌蛋白质含量较高，具有高度保守性［32］，多样性和丰富性，且易于提取和分离等特点，目前利用蛋白质作为细菌鉴定的生物标志物得到广泛应用。 Camara等［33］利用 MALDI-TOF MS 检测大肠埃希菌的菌体蛋白，鉴定出了野生型大肠埃希菌和抗氨苄西林大肠埃希菌。

利用MALDI-TOF MS 对分枝杆菌进行鉴定时，需要通过特殊的蛋白提取步骤，萃取蛋白，进行分枝杆菌蛋白标志物数据库的建立，通过比对结果达到对分枝杆菌鉴定的目的［34］。

Zarate［35］研究证实，用 MALDI-TOF MS 通过低分子量蛋白谱的建立，对厌氧菌的鉴定结果与传统细菌鉴定技术的一致率达到95.3%。 MALDI-TOF MS 在提高厌氧菌导致的内源性感染疾病的快速诊断率方面具有更高的价值。

2.2 真菌 MALDI-TOF MS 鉴定临床常见真菌如酵母菌的准确性比较高［36］。 Becker 等［37］研究显示MALDI-TOF MS 诊断丝状真菌的准确率达到95.4%。 黄艳飞等［38］研究显示使用“水平震荡培养法”配合改良磁珠提取法提取蛋白，利用质谱鉴定丝状真菌鉴定到属的准确率可以达到99%。 目前已经建立了庞大的MALDI-TOF 丝状真菌数据库，这对于丝状真菌鉴定具有可观的临床应用价值。

2.3 病毒 由于病毒具有细胞内寄生的特点，所以分离培养很困难，而且耗时长。 MALDI-TOF MS 凭借快速、高通量的特点，在病毒鉴定方面具有明显的优势。 万敏等［39］研究显示利用 MALDI-TOF MS 对人乳头瘤病毒（HPV）进行分型诊断的敏感性88.2%，特异度88.9%；对高危型HPV 诊断的准确率达到了100%。 MALDI-TOF MS 对于病毒的诊断与传统技术相比具有很高的一致性［40］，同时又具备高通量、快速等特点，对于未来广泛应用于病毒检测具有广阔的前景。

2.4 放线菌 放线菌是一类具有丝状分枝细胞的原核微生物。 它的细胞构造、细胞壁的化学成分和对噬菌体的敏感性与细菌相同，但在菌丝形成以及外生孢子繁殖方面与丝状真菌相似。 大多数放线菌是条件致病菌，可以导致放线菌病，造成皮肤软组织、头颈部、以及生殖器官脓肿［41］。 孙铭艳等［42］研究显示来自患者脓肿皮肤的菌株，培养72 h 后，可见白色、细小、无溶血环的菌落，经过革兰氏染色涂片可以见到革兰氏染色阳性杆菌， 但是未见明显菌丝，VITEK2 Compact 鉴定结果为肺炎链球菌和双歧杆菌属， 与染色镜检结果不符。 使用MALDITOF MS 进行鉴定结果为欧洲放线菌。 该研究还对菌株 DNA 进行提取，选用 16S rRNA［43］基因测序进行鉴定，鉴定结果也为欧洲放线菌，与MALD-TOF MS 鉴定结果一致。 因MALDI-TOF MS 具有高通量、快速的诊断优势，所以其对放线菌病的及时诊断具有非常重要的意义。

3 MALDI-TOF MS 面临的挑战

MALDI-TOF MS 虽然具有快速、高通量、敏感、特异等优点，但是在临床应用过程中还存在很多挑战，缺乏操作的规范标准化要求，例如质量控制、样品的前处理流程、鉴定流程、报告及审核流程、报告解释、生物安全标准、仪器操作的标准化、数据库的质量都会影响最终的鉴定结果。 目前大肠埃希菌和志贺菌运用MALDI-TOF MS 还不能严格区分，需要附加试验才能加以鉴定［44］；对于变形杆菌的鉴定，MALDI-TOF MS 也只能鉴定到属， 无法进行种的鉴定［45］。

MALDI-TOF MS 虽然存在一定的局限性，但通过规范标准化操作规程，完善建立的数据库，该技术定能以高效、快速、广泛的优势在肿瘤诊断领域和临床微生物诊断领域中更好地服务于临床，服务于患者。