牙源性干细胞成骨能力的研究进展

程倩钰，郑荔文，林居红★

（1.重庆医科大学附属口腔医院 儿童口腔科，重庆；2.口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆；3.重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆）

0 引言

面部骨质缺损常由肿瘤，创伤和炎症引起，而衰老，骨质疏松，糖尿病等一些系统因素会加重骨丢失，从而影响骨修复[1,2]。当前，在临床上，重新建造破坏骨头的主要方法是自体或者异体骨移植。其中，最不可被忽略的问题有两个，分别是：手术创伤和免疫排斥[3]。近年来，基于干细胞的组织工程用于恢复骨质缺损显示出了巨大潜力。而在这些干细胞里，由于牙源性干细胞具有自身优异的自我更新能力、高度增值性，并且比较容易获得，比如可以在正畸牙和智齿中高效获得，因此受到了学者们的青睐。同时，由于它是一种成体干细胞，所以比胚胎干细胞以及诱导多能干细胞更能被大众接受，并且在维持、更新以及修复牙和牙周围组织方面起到不可或缺的作用[4]。

学者已经广泛而细致地研究了牙源性干细胞的培养、鉴定、迁移、增殖以及分化，并且做了大量的体内和体外实验。目前，一些干细胞，如牙周膜干细胞（PDLSCs）、牙囊干细胞（DFSCs）和牙龈干细胞（GMSCs）已成功从一些牙体牙周组织（牙髓、牙周膜、根尖乳头及其他的牙体牙周组织）中分离和培养。我们知道，一般间充质干细胞可以表达相同的表面标记物，并能成骨、软骨，成脂及成神经分化，而牙源性干细胞来自于神经嵴的间充质干细胞，因此它也具有这种特性[5]。再具体一点，它可以表达神经干细胞标记物nestin 和notch，同样也表达如血管生成素1（Ang-1），环加氧酶-2（Cox-2），肝配蛋白B2 和成牙本质标记物如牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白1(DMP-1) 等一些与内皮细胞有关的表面分子。不仅如此，成骨标记物也可以被它表达，例如碱性磷酸酶（ALP），I 型胶原蛋白（Col I），骨钙蛋白（OCN）和骨桥蛋白（OPN）[6,7]。有文献表明，在特定条件下，牙源性干细胞能够分化为骨细胞和成骨细胞，因此牙源性干细胞是骨再生潜在的干细胞来源之一[8]。牙源性干细胞的成骨能力是被大家接受的，但是对于不同的牙源性干细胞，它们的成骨潜力是不一样的，因此接下来我们将详细概述不同干细胞的成骨潜力、影响因素和在骨再生中的应用。

1 DPSCs

牙髓是一种位于由牙本质围成的髓室和根管内的一种疏松结缔组织。它不仅可以形成牙本质，并具有营养、感觉、防御能力以及创伤修复再生能力。2000 年，有人从人的第三磨牙的牙髓中提取出呈纤维细胞样形态的DPSCs。它不仅具有与BMSCs（骨髓间充质干细胞）相似的功能，而且具有成骨、成脂、神经源性、软骨源性和肌源性分化潜能，还可以修复和再生牙髓牙本质复合体[9]。已有临床试验证明，因外伤牙髓坏死的年轻恒牙用乳牙的DPSCs修复，牙髓组织可以再生，并且还促进了牙根发育[10]。STRO-1、CD29、CD44、CD46、CD73、CD105、CD106 等多种间充质干细胞表面标志物都可以由DPSCs 表达，并且它的增殖和克隆能力很强，能在不同诱导环境下多向分化。

1.1 DPSCs 的成骨潜能

CD44+/RUNX2+成骨细胞前体可以由DPSCs 分化，在成骨诱导培养基中进一步分化为成骨细胞。将DPSCs 在成骨诱导液中培养5-6 周后，沉积了高密度散在的钙盐，并检测到了ALP 的表达，这些结果证实了DPSCs 的成骨分化能力[9]。值得注意的是，有人将人的DPSCs 移植到大鼠缺损的颅骨中，这些DPSCs 可以在不受机体排斥的情况下分化为成骨细胞[11]。

1.2 DPSCs 成骨能力的影响因素

与地塞米松比较，壳聚糖更能提升DPSCs 的增值能力，并且促进成骨向的早期分化[12]。同时，一些研究证实DPSCs 的成骨分化可以被许多的生长因子促进。例如，骨形态发生蛋白-2 (BMP-2) 能促进DPSCs 成骨分化。当BMP-2 转染DPSCs 后再移植到裸鼠皮下之后，形成了骨髓样细胞、骨样细胞、矿化组织等，并且形成新骨的能力更强，而且在新骨表面，骨细胞样细胞被有序排列成[13]。DPSCs 由酪氨酸激酶受体的配体B2（EphrinB2）过表达后，将会有更多的钙盐在体外沉积，RUNX2，BMP2，OCN 基因和蛋白表达水平也变得更高。在体外实验犬骨缺损模型中，EphrinB2修饰的犬DPSCs 加速了骨再生，表明EphrinB2 信号可能是促进DPSCs 成骨的潜在靶点[14]。另外，某些生物材料也能提升干细胞的成骨能力，比如磷酸钙生物陶瓷与硅酸钙的结合可有效诱导DPSC 的ALP 和OCN 表达[15]。

1.3 DPSCs 在骨再生中的应用

PLC-BCP（聚-ε- 己内酯- 双相磷酸钙）生物支架材料与DPSCs 相结合，被一起植入到兔颅骨缺损处，不仅形成了结构更良好的血管化骨组织，并且再生能力也更强[16]。与单一的细胞植入相比，在支架材料（如在藻酸盐凝胶、致密胶原凝胶）上固定DPSCs 之后再植入裸鼠皮下形成的新骨成骨能力更强[17,18]。DPSCs 也可用于治疗牙槽骨缺损。具体步骤是：自体的DPSCs 在患者拔除智齿时被提取，然后混合到胶原支架后一起被植入拔牙窝，三个月后拍片发现，在牙槽窝里新的骨头形成，并且相邻的磨牙中的牙槽骨高度及牙周附着都恢复地很好。这个结果说明，DPSCs 治疗更好的实现骨和牙周组织的修复[19]。因此，DPSCs 在颌面部骨再生中将占据不可或缺的地位。

2 SHED

SHED 是一种未分化的间充质干细胞，可以从人脱落乳牙的牙髓组织中分离得到。与DPSCs 一样，SHED 都是来源于牙髓，并且具有多向分化能力以及能诱导产生牙髓样组织，不同之处在于细胞形态、增殖能力及成骨能力等方面[20]。STRO-1，CD146(MUC18)，ALP、人细胞外基质磷酸糖蛋白（MEPE）、内皮抑素、Nestin、βIII-微管蛋白等多种间充质干细胞表面标志物由SHED 表达[21]。

2.1 SHED 的成骨潜能

在含有L- 抗坏血酸-2- 磷酸、地塞米松和无机磷酸盐的培养液中培养SHED 四周后，Miura 等[21]检测到阿利扎林红阳性结节的形成，通过对Westernblot（蛋白免疫印迹）的分析，ALP，MEPE 和BSP（骨唾液酸蛋白）等成骨标记物上调，并且证明了SHED 的成骨能力。受体小鼠细胞能在SHED 的诱导下分化成骨形成细胞[21]，而有研究表明，通过检测将SHED 移植到免疫功能缺陷的小鼠体内后新形成的骨组织的骨再生能力与骨髓间充质干细胞（BMMSC）相似，表明SHED 本身具有成骨分化的能力[22]。

2.2 SHED 成骨能力的影响因素

与地塞米松相比，视黄酸提升SHED 成骨能力的效果更好，而且与胰岛素结合的视黄酸具有更好的促成骨作用[23]。通过半定量PCR 分析用BMP-4 处理脱落乳牙干细胞后，CBFA1（核心结合因子a1），Osterix（锌指结构转录因子）和Osteocalcin（骨钙素）等成骨相关基因上调表达[21]。与DPSCs 相反，SHED 的ALP 活性，矿化结节、下游成骨相关基因表达都降低，并且它的成骨分化被碱性成纤维细胞生长因子所抑制[24]。

2.3 SHED 在骨再生中的应用

SHED 的成骨潜能在小型猪牙槽骨缺损实验中得到证实[25]。具体操作为：在小型猪的颏部唇侧形成骨缺损，将混入磷酸三钙(β-TCP) 支架的自体脱落乳牙干细胞植入缺损处，4 周后检测退化的支架材料时发现形成骨组织和血管，六个月后发现，在缺损处有大量新生骨形成。还有学者将小型猪的牙槽骨缺损处植入混合富血小板血浆的异体干细胞（狗的SHED）[26]，但是目前为止还没有研究报道用SHED 修复人的颌面部骨缺损，因此，需要大量的临床试验来证实。

3 PDLSCs

牙周膜是特有的纤维结缔组织，位于牙骨质和牙槽骨之间，与牙齿的维护和支持有关。牙根与牙槽骨之间的动态连接，由从牙周膜中分离出来的PDLSCs 的增殖分化维持着，并且平衡着咀嚼压力[27]。PDLSCs 表达的表面分子有α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）、ALP、OPN、OCN、FGF-2，CD105、CD146 和CD166 等。

3.1 PDLSCs 的成骨潜能

牙周膜干细胞在体外可以诱导形成成骨样细胞，并且增强了ALP 染色，生成了钙结节，也提高了成骨相关蛋白的表达水平[28]。有研究表明，使用间接共培养方法之后，成骨细胞前体成骨向分化和破骨细胞前体破骨向分化可以用PDLSCs 促进[29]。大鼠的牙周缺损可以用在体内与羟基磷灰石混合后的牙周膜干细胞修复，这样不仅可以修复缺损的骨组织，也可以形成新的牙周附着。

3.2 PDLSCs 成骨能力的影响因素

作为最有效的成骨诱导剂之一，BMP-9 通过牙周膜干细胞中的MAPK 介导能够诱导成骨分化[30]。PDL 细胞可以在与BMP-2和BMP-7 结合时的刺激下分化为成骨细胞，同样也提升了矿化组织标志物的表达，但是细胞毒性会在浓度大于10ng/mL 时产生[31]。Liu 等[32]证实，在牙周膜干细胞成骨分化中Wnt 信号可以起到作用，并且ALP 活性在激活Wnt 信号通路后明显增高。在混合培养PDLSCs 与 VEGF(血管内皮生长因子)之后，明显增强了ALP 活性，促进了钙结节的生成，同时也增强了下游成骨相关基因的表达[33]。

3.3 PDLSCs 在骨再生中的应用

牙周膜干细胞的成骨潜能在小型猪牙槽骨缺损实验中得到证实。在缺损处植入与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP）支架结合后的自体PDLSCs，形成大量的血管化骨[34]。在3 位有严重的牙周病患者的骨缺损处，其中2 人能形成临床组织再生，而另一人未形成，但可以改善牙齿松动度和探诊深度[35]。与其他牙源性干细胞相比较，PDLSCs 成骨能力强，可以再生牙骨质-牙周膜复合体，如果与细胞因子和支架材料结合之后，将是一种重要有效的牙槽骨修复的方法。

4 SCAPs

松散地附着在没有成熟的恒牙顶端的软组织被称为根尖牙乳头，其与牙髓之间有一个富含间充质干细胞的区域。可以从酶消化和外植体培养从中提取SCAPs，也可以从拔除的智齿中获得，并且与牙髓、牙周膜干细胞相比，它具有更高的增殖能力，因此受到了青睐[36]。由于根尖牙乳头干细胞的高自我更新能力和低免疫原性，如成骨源性、牙源性、神经源性、脂肪源性、软骨源性和肝源性等各种细胞谱系可以被分化得到（FGHI）。标记物STRO-1、OCT3/4、Sox-2、Nanog、Notch3、波形蛋白、CD13、CD24、CD29 、CD44 等可以SCAPs 阳性表达。其中在DPSCs 中不可以检测到CD24，因此可以区分开SCAPs 和DPSCs[37]。

4.1 SCAPs 的成骨潜能

骨相关基因在体外的SCAPs 成骨诱导培养后被检测到，ALP、RUNX2、OCN 表达上调，红染的钙结节可以用茜素红染色检测到[38]。免疫功能不全的大鼠体内被植入SCAPs，周围包绕着骨样细胞和牙骨质样细胞的牙骨质-编织骨样组织被检测到，因此SCAPs 成牙骨质、成骨分化的能力得到证实[39]。

4.2 SCAPs 成骨能力的影响因素

多种因子可以影响SCAPs 的成骨能力，比如骨形态发生蛋白2（BMP2），BMP9，SH3 和多个锚蛋白重复结构域2，GATA 结合蛋白4 ，核因子I-C、磷酸二氢钾，经典的NF-kappaB 信号通路，wnt/β-catenin 信号通路等。与牙周膜干细胞一致，胰岛素样生长因子也能使SCAPs 成骨作用增强[40]。

4.3 SCAPs 在骨再生中的应用

在裸鼠肾包膜内植入与可吸收明胶海绵支架混合的SCAPs后，形成大量钙化组织[41]。SCAPS 移植治疗骨缺损的可行性也得到了证实，在被植入与支架材料混合的干细胞之后的免疫功能不全的小鼠皮下，在一段时间后生成了异位骨组织[42]。但是目前为止，还没有研究根尖牙乳头干细胞的临床实验，这需要大量实验研究SCAPs 的表征，分化调控，及在再生领域的应用。

5 DFSCs

围绕在发育中的牙齿周围的由外胚间叶衍生的疏松结缔组织被称为牙囊，并且在牙齿的不同阶段起着不同作用，并且牙周膜细胞、牙骨质细胞和成骨细胞的祖细胞在牙囊中分化。在不同的微环境中培养DFSCs，牙本质再生、矿化基质的形成、牙髓牙本质复合体及牙周膜的形成都得到促进[43]。从拔除的阻生智齿，或年轻的正畸牙中提取的DFSCs 可以显示出成纤维细胞样的形态，STRO-1、CD13、CD31、CD44、CD73、CD105、CD106、CD146，SSEA-4、OCT-4 表面标志物可以表达[44]。

5.1 DFSCs 的成骨潜能

Sonoyama 等[45]证明DFSCs 可以分化为成骨细胞，具有成骨潜能，因为他们在体外将DFSCs 成骨诱导培养，生成了钙结节并且形成了类骨质样结构。小鼠和大鼠的DFSCs 在牙冠形成阶段可以分化为成骨细胞系得到证实[46]。有研究表明，DFSCs 与PDLSCs、BMSCs 成骨能力相近，他们将猪的这些物质用于修复临界骨缺损，4 周之后形成了并无明显差异的新骨[47]。

5.2 DFSCs 成骨能力的影响因素

I 型胶原、IV 型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白四种细胞外基质被研究对DFSCs 增值和分化的影响，Hondal 等[47]表明促进细胞增值并促进成骨向分化的只有I 型胶原。Xu 等[48]在地塞米松和人重组BMP-2 中培养细胞，之后混合了三维支架材料β-TCP，然后植入到免疫缺陷小鼠背部，形成了新骨，证实多种细胞因子能调节DFSCs 的成骨能力。BMP-9 能显著提高DFSCs 的成骨潜能也得到证实[49]。

5.3 DFSCs 在骨再生中的应用

研究者将干细胞与与脱钙骨基质支架和纤维蛋白凝胶混合后植入迷你猪下颌骨的圆柱形骨缺损处，8 周以后形成了新骨，并且是皮质骨，osteocalcin 和VEGF 表达也明显上升[50]。但是，DFSCs临床研究还未见有人报道，因为复杂的牙囊结构和需要优化的DFPC 提取，为了修复组织缺损，其分化基质和调控需要大量实验研究。

6 GMSCs

牙龈是一种结构组织，覆盖在牙槽突表面和牙齿颈部周围的口腔粘膜，包括上皮及下皮，并且它的修复能力很强。GMSCs 是一种间充质干细胞，易分离得到，具有抗炎和抗菌作用，并且增殖很快。CD29，CD44，CD90，CD105，CD146，和STRO-1 都是牙龈干细胞表达间充质干细胞的表面标志物。

6.1 GMSCs 的成骨潜能

通过培养来自于39 个人健康和发炎的GMSCs，Ge 等[51]得到这两种细胞群都可以分化成骨细胞，但是有炎症的GMSCs 的分化能力不如健康的。并且移植的GMSCs 可以在下颌骨缺损和颅骨缺损处形成新骨也得到了证实，表明骨组织缺损可以被GMSCs 修复[52]。

6.2 GMSCs 成骨能力的影响因素及在骨再生中的应用

目前对影响GMSCs 成骨能力的因素的研究少之甚少。大鼠缺损区新骨（小且局限）的形成可以在GMSC 与胶原蛋白凝胶的结合下得到促进，GMSCs 直接参与骨修复，还能募集宿主骨祖细胞以促进骨再生[53]。狗的牙周组织缺损被GMSCs 之后，牙槽骨，牙骨质和功能性牙周膜明显增加[54]。不管在有无炎症环境下，GMSCs 的分化潜能都低于PDLSCs，但是在炎症性牙周疾病的治疗中，GMSCs 会有独一无二的作用，所以还需要大量的研究。

牙源性干细胞自提出以来就备受关注，因为它比较容易获得，分化潜能大，更新能力强，传代后保持干性，和伦理的优越性。多种牙源性干细胞的成骨特性被大量研究证实，并且也提升了成骨调控和应用。但是在用于人体修复骨组织缺损这一方面，仍然面临着许多挑战。首先，分离纯化没有特异性表面标记物的牙源性干细胞这一问题很棘手。其次，现在还尚未清楚许多牙源性干细胞分化的调控机制，在用于临床之前，还要进行大量研究。但是我们相信，在科学技术快速发展的这一背景下，干细胞颅面组织工程将会发挥更大的临床应用潜能。