细胞骨架相关蛋白4对肿瘤诊断和预后的作用

刘锦燕，赵珺涛，王恒如，黄嘉仪，王钰婷，项明洁,

1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025

恶性肿瘤是危害人类健康的疾病之一，其每年的全球发病率和死亡率分别为23.7%和30.0%[1]。在我国，人口老龄化、城市工业化等进程的加剧以及人们生活方式的改变等原因，使得近年来癌症的发病数和死亡数持续增加。目前，由恶性肿瘤带来的医疗负担已成为全世界不容忽视的社会公共卫生问题。

细胞骨架相关蛋白4（cytoskeleton-associated protein 4，CKAP4），即p63，是一种非糖基化的Ⅱ型膜蛋白。该蛋白的氨基酸序列由3个部分组成，包括内质网腔内区、胞质区以及跨膜区。其胞质的酰化位点发生棕榈酰化后，可以锚定微管来维持内质网的空间分布。由于在结构上的相似、功能上的相近以及基因上的高度同源，CKAP4被纳入p53家族（p53 family），该家族具有调控细胞周期、修复DNA损伤、诱导变异细胞凋亡等多样抑癌功能。近年来越来越多的研究[2-4]针对CKAP4在肿瘤中的标志物作用展开，由于CKAP4在肿瘤组织、血清和细胞中的高度表达，推测其可能是多种肿瘤的标志物之一。本文就CKAP4的亚型和功能，以及CKAP4作为肿瘤诊断性指标及预后性指标的研究及应用进行综述。

1 CKAP4的亚型与功能

1.1 CKAP4及其亚型

CKAP4由601个氨基酸组成，相对分子质量为65 800，具有106个氨基酸的氨基末端胞浆尾（AA 1-105），1个单一跨膜结构域（AA 106-127）和1个包含474个氨基酸的大胞浆结构域（AA 128-602）[5]。最初作为前高尔基体膜稳定的锚定驻留蛋白，CKAP4被发现存在于内质网（endoplasmic reticulum，ER）中，且该蛋白在胞内的功能与其N端的23个氨基酸息息相关，并在结构上通过自交联固定在粗面内质网上[6]。

p63基因在延伸编码的39个氨基酸序列中可发生突变，从而使得CKAP4在表观功能上呈现出较明显的差异。因此CKAP4分为2个亚型：一类为TAp63，具有p53性质；另一类为ΔNp63，缺乏p53相关功能[7]。

在表达部位方面，表皮中ΔNp63亚型的表达比TAp63更为丰富。在来源方面，ΔNp63存在于表皮、牙齿和毛囊中，而TAp63来自皮肤源性前体细胞（skin-derived precursors，SKPs）、真皮干细胞。TAp63和ΔNp63表达之间呈拮抗关系，研究[8]显示在TAp63亚型选择性丢失后，内源性ΔNp63α蛋白会表达上调，而当ΔNp63α亚型升高时，TAp63则随之下调。

1.2 CKAP4的功能

不同亚型的CKAP4具有不同的功能。TAp63隶属于p53家族，具有抑制癌细胞新陈代谢、诱导细胞衰老死亡、调控少数黏附基因等功能。然而在肿瘤细胞中TAp63亚型的占比较少，而ΔNp63亚型则主导了细胞黏附以及维持细胞存活的功能，在上皮发育中发挥不可缺少的作用，以促进癌细胞在人体内的存活。可以说，在鳞状细胞系中TAp63亚型的减少和ΔNp63亚型的增多造成了肿瘤侵袭和转移功能相关基因的上调。因此，大多数肿瘤细胞中CKAP4因ΔNp63亚型水平的增高而表达上调，常标志预后不良、病情恶化；少数肿瘤中CKAP4因TAp63亚型的下调而表达水平降低，亦成为预后不良的指征。此外，Carroll等[8]发现ΔNp63亚型会抑制p53家族的转录，但近年来研究[6,9-11]证明ΔNp63亚型对大量基因如整合素β4、α6和α3，层连蛋白γ2以及纤维连接蛋白的转录和表达均具有促进调节的作用。

2 CKAP4在肿瘤诊断中的价值

2.1 CKAP4在肿瘤细胞中的表达及诊断价值

2.1.1 肺癌 Bir等[12]对62例原发性肺癌组织样本进行了CKAP4免疫组织化学染色，结果显示在5个肺鳞状细胞癌（lung squamous cell cancer，LSCC）中的24个样本呈强阳性，20个肺腺癌中的6个样本及1个大细胞癌样本呈轻度阳性；继而说明，CKAP4染色在低分化LSCC中有显著特异性。Yanagita等[2]研究了正常肺组织及70例手术切除的肺癌组织，包括42例肺腺癌（lung adenocarcinoma）、24例LSCC、2例小细胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和2例肺大细胞神经内分泌癌（large cell neuroendocrine carcinoma，LCNEC）；结果显示，CKAP4在4种肺癌肿瘤细胞的细胞质和肿瘤间质中的成纤维细胞中均有所表达，而正常肺支气管上皮细胞、肺泡细胞或基质细胞中均未见表达。目前，CKAP4已被作为特异性标志物广泛应用于LSCC的组织病理学诊断[13]。

Lilo等[14]对126例肺癌患者的细针穿刺细胞进行研究，包括50例肺腺癌、56例LSCC、8例SCLC和12例未分化癌；结果发现，在上述前3类肺癌细胞中CKAP4的阳性表达率分别为62.8%、89.5%和50.0%，且在未分化癌细胞内则未检测到CKAP4表达。继而说明，CKAP4的肺癌诊断灵敏性上还存在一定局限。

2.1.2 乳腺癌 Maeda等[3]对乳腺纤维腺瘤（fibroadenoma，FA）和乳腺导管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）的组织样本进行鸡尾酒染色[即多种蛋白抗体包括CKAP4和细胞角蛋白（cytokeratin，CK）7、18、5、14抗 体的联合应用，进行组织学诊断］，结果发现DCIS患者的CKAP4免疫阳性的数量与FA患者间存在较大差异（P=0.005），提示CKAP4可用于鉴别FA和DCIS。

同样地，Tanaka等[15]研究了103例通过细针穿刺收集的乳腺组织样本，进行鸡尾酒染色，结果显示CKAP4对乳腺癌的诊断敏感度和特异度分别为97.8%和91.7%。Osugi等[16]采用液基细胞学（liquid based cytology，LBC）对乳腺癌经细针穿刺采集的细胞进行处理后再行CKAP4免疫染色，并与常规巴氏染色法进行比较。结果显示，CKAP4免疫染色法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断准确率分别为99.0%、99.0%、99.5%、97.8%、99.0%，而常规巴氏染色法则分别为88.3%、89.1%、94.8%、77.4%、88.6%；提示CKAP4免疫染色法更优。

2.1.3 食管癌 Shinno等[17]对119例食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者的食管黏膜组织样本进行研究，通过免疫组织化学染色和mRNA水平检测CKAP4；免疫组织化学染色结果显示CKAP4在66例患者的肿瘤组织中呈阳性，而mRNA水平检测显示CKAP4在86例患者的肿瘤组织中呈阳性，且与非肿瘤区域相比CKAP4基因mRNA水平有显著升高。同时，该研究针对免疫缺陷的小鼠模型进行分析发现，CKAP4是体内形成ESCC肿瘤所必需的。

2.1.4 肝癌 Li等[18]研究发现，在139例肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者的组织样本中，有63.6%的肿瘤组织存在CKAP4高度表达，而在邻近的正常组织中仅有39.2%的样本高表达CKAP4，在肿瘤组织和正常组织中该蛋白的表达差异具有统计学意义。

2.1.5 胃癌 Song等[19]对101例胃癌黏膜组织样本进行研究，发现CKAP4在49个样本中强表达、52个样本中弱表达；而在25个正常胃黏膜组织样本中，则仅在6个样本中强表达、19个样本中弱表达；且在胃癌黏膜组织和正常胃黏膜组织样本中，CKAP4的表达间差异具有统计学意义。

2.1.6 淋巴瘤 Fukushima等[20]研究了65例弥漫大 B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）、28例滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）和5例套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）的非霍奇金淋巴瘤组织样本，结果显示有22例（33.8%）DLBCL和15例（53.6%）FL的样本中存在CKAP4表达，而5例MCL样本中均未有表达。

2.2 CKAP4在血清中的表达及诊断价值

2.2.1 肝癌 朱锦舟等[4]研究了88例HCC、91例肝硬化、87例慢性乙型肝炎患者及健康对照者的血清样本，结果显示HCC患者血清样本中CKAP4的表达水平高于其他3组，且差异具有统计学意义（均P＜0.001）。在HCC患者血清样本中，CKAP4与甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）相比，差异无统计学意义（P=0.248）；且在早期HCC的诊断指标中，CKAP4的敏感度为 78.4%、特异度为 73.7%，均优于AFP。因此提示，CKAP4可作为HCC诊断的血清肿瘤标志物。

2.2.2 胰腺癌 Kimura等[21]通过2种酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测发现胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者组的血清CKAP4值高于对照组，且其可在PDAC细胞的小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，SEV）中被检测到，表现出外泌体特征。继而提示，外泌体中分泌的CKAP4可作为PDAC的血清肿瘤标志物。

2.2.3 肺癌 Yanagita等[2]针对271例肺癌患者和100例健康对照者的血清样本中的CKAP4检测发现，肺癌患者的CKAP4水平显著高于健康对照者（P=0.000），且Ⅰ期肺腺癌或LSCC患者的血清中CKAP4水平也高于健康对照者（P=0.000）；继而提示，CKAP4可作为肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物。

2.2.4 食管癌 Chen等[22]通过对207例ESCC患者的血清CKAP4进行研究发现，患者的血清CKAP4水平高于健康对照者（P＜0.001），通过血清CKAP4鉴定ESCC的受试者操作特征曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.675；此外，随访后通过多因素Logistic回归分析发现病理性淋巴结转移是最差的预后因素，其次是血清CKAP4水平的异常上调。上述结果表明，血清CKAP4水平可能是ESCC潜在肿瘤标志物。

3 CKAP4在肿瘤预后判断中的价值

CKAP4与多类肿瘤的预后存在相关性。Shinno等[17]的研究显示，在119例ESCC患者中有46例（38.7%）患者的Dickkopf-1（DKK1）和CKAP4均为阳性，而该2种蛋白质表达的患者表现出不良的预后和较差的无复发生存率；经多变量分析显示，该2种蛋白质的表达是ESCC不良预后因素。Takahashi等[23]也针对ESCC的患者的CKAP4和p53的蛋白表达及预后进行研究，结果显示不表达上述蛋白的患者的生存率明显较低（P=0.030）。在Massion[24]对LSCC的研究中发现，p63基因组扩增和蛋白质染色强度与患者术后更好的生存率相关，且在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中p63的扩增和过表达可延长患者的存活期。Sun等[25]发现5%的透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）患者出现CKAP4过表达，预后明显恶化（CKAP4的上调与ccRCC的恶化特征有关）。Song等[19]对CKAP4与胃癌患者的预后情况进行研究，通过单变量分析显示阳性CKAP4表达与较短的生存率、较低的5年生存率显著相关（P=0.001）；Cox多因素回归分析显示，转酮醇酶 1（transketolase-like protein 1，TKTL1）和CKAP4的表达是胃癌的独立预后因素。Ma等[13]则发现，在LSCC中具有高表达水平的CKAP4的患者的生存率显著高于低表达水平的患者（P＜0.050）；经Cox多因素回归分析显示，高表达水平的CKAP4是良好存活的独立预后因素。Li等[18]认为在HCC生存分析中，与低表达CKAP4的患者相比，高表达的患者似乎具有更长的总体生存期和无病生存期。Hegazy等[26]发现，在膀胱癌中CKAP4的低表达（P=0.005）与肿瘤复发、进展之间存在显著相关性。Loljung等[27]对舌鳞状细胞癌研究发现，CKAP4表达与患者的2年生存率显著相关（P=0.018）；若有超过80.0%的肿瘤细胞强表达CKAP4，则患者的2年生存率较低；且在5年生存率中，CKAP4高表达与较差的预后相关性更加明显。Zhou等[28]对中国人腺样囊性癌进行研究发现，CKAP4阳性表达是患者5年生存率较好的预后指标；同时，不同于欧美的相关研究[29]，该研究还发现CKAP4阳性表达是患者10年生存率较差的预后指标。

4 结论

CKAP4是定位于细胞内质网上的结构稳定蛋白，主要分为TAp63亚型和ΔNp63亚型。前者属于p53家族，具有抑制肿瘤细胞等作用；后者具有主导细胞黏附及存活的功能，能够在上皮细胞发育中发挥关键作用，且在大部分肿瘤细胞中CKAP4因ΔNp63的高表达而呈现高水平表达。随着癌细胞进一步浸润发展，在上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的过程中ΔNp63受到抑制、CKAP4水平可能也逐渐下降；而癌症后期低水平的CKAP4则是预后不良的体现。

在临床诊断中，CKAP4指标可广泛应用于肺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌、淋巴瘤、舌癌、腺囊样癌、头颈癌等[28,30-31]恶性肿瘤，尤其是LSCC和乳腺癌的诊断中，且特异性和灵敏性均已得到证实。然而，将CKAP4作为血清学诊断指标进行的研究尚不多见。现有研究结果表明，作为诊断指标之一，CKAP4在肝癌、胰腺癌、肺癌、食管癌等恶性肿瘤中具有一定的应用前景。而在预后指标应用中，CKAP4在不同肿瘤以及各肿瘤不同阶段的差异性较大，且研究结论尚存在矛盾之处，这可能与其2个亚型在不同部位的表达及相互拮抗的作用有关，尚需要开展进一步研究。