鸢尾苷元对辐射损伤小鼠造血系统的防护作用

王金凤，高 云，王 芳，王国玉，赵庆兰，杨翠燕

(中国人民解放军联勤保障部队第九六四医院，吉林 长春130062)

随着科技的发展，核军事、核事故的威胁日趋严重，战地救援、医疗救护的辐射防治任务随之加剧；核技术推广应用给人类带来益处的同时，职业性照射、医源性照射人员大幅增加，电离辐射已成为威胁人类健康的重要因素。

研究发现[1]不论天然甾体激素，还是人工合成非甾体激素，以及雌激素衍生物都具有良好的辐射损伤防治作用。尽管如此，但因其对人体的毒副作用大，实际应用受到很大的限制。与此相比，中药具有药源广泛、服用方便、毒副作用低等特点，在辐射防护领域的研究中显示出一定的潜力和优势，倍受关注。已有研究发现部分黄酮、皂苷和多糖等单体成分具有抗辐射损伤作用[2]。其中，染料木黄酮作为一种植物雌激素类化合物，具有抗氧化损伤、刺激造血干细胞增殖、促进损伤DNA修复等作用[3]，成为美国研发的军用抗辐射损伤药物，并已进入临床试验阶段[4]。鸢尾苷元是葛花的主要活性成分，为异黄酮类化合物，结构与染料木黄酮相似，只是A环C6位引入一个甲氧基，可有效清除自由基，抗炎、抗肿瘤、保护心血管，安全多效[5-8]。本文研究鸢尾苷元对辐射损伤小鼠造血系统的防护作用，为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级昆明小鼠，雄性，5周龄，体重 24-30 g。由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，合格证号：SCXK(辽) 2020-0001。

1.2 试剂与仪器

鸢尾苷元(自制，纯度为 98.56%，批号20200711)；RPMI 1640培养基(L210KJ,上海源培生物科技有限公司)；XN2000全自动血细胞分析仪(希森美康医用电子有限公司)；CPA2P-F 电子天平(德国赛多利斯股份公司)；UV-3200S紫外分光光度仪(上海美谱达仪器有限公司)；TGL-16G菲恰尔台式离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)；CK40倒置显微镜(OLYMPUS公司)；Compact医用直线加速器(ELEKTA公司)。

1.3 方法

1.3.1照射条件

小鼠装在有机玻璃盒内，X射线源(Compact医用直线加速器)，照射距离：100 mm；照射视野：10 cm×10 cm；照射剂量率350.0 MU/min，吸收剂量为4.0 Gy。

1.3.2分组及给药

雄性昆明小鼠200只，适应性饲养1周后，随机分为5组，每组40只。即正常对照组、模型组(单纯辐照组)、鸢尾苷元低、中、高 3个剂量的给药组(辐照+鸢尾苷元)。给药组每日分别给予鸢尾苷元40、80、160 mg/kg bw[9,10]。药品以0.5%羧甲基纤维素钠制备成混悬液，分早晚2次灌胃给药，灌胃体积为0.1 mL/10 g。对照组和模型组每日给予同等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。连续给药3 d，除对照组外，其余各组小鼠于第4天灌胃后进行一次全身性照射。

1.3.3脏器指数和外周血象检测

分别于照射后第7、14、21和28 d，每组随机取小鼠10只，将小鼠称重后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏取血1 ml加入EDTA-K2的抗凝管中，全自动血球分析仪测定全血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和血小板(PLT)数量。分离胸腺、脾脏，小心去除粘连的脂肪及结缔组织，吸干水分后称重，计算脏器系数(即脏器重/体重，mg/g)。取两侧股骨，置生理盐水中备用。

1.3.4骨髓有核细胞(bone marrow nucleated cells，BMNCs)计数

分离股骨，去除附着的肌肉组织，生理盐水冲洗干净。剪开两端少许。用带有4号针头的无菌注射器吸取RPMI 1640培养液2 ml，冲洗出全部骨髓，过4号针头1次。3 000 r/min 离心10 min，去上清。加0.5 ml RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，加入适量的白细胞稀释液(冰乙酸2 ml，双蒸水 98 ml，1%亚甲基蓝液3滴)，室温静置10 min，混匀后计数板计数。

1.3.5骨髓DNA含量测定

取另一股骨，用注射器吸取5 mmol/L CaCl2溶液10 ml，将股骨中全部骨髓细胞冲出至15 ml离心管中，混匀，4℃静置30 min，3 000 r/min 离心10 min，弃上清；加入0.2 mmol/L HClO410 ml，90℃水浴加热 15 min；冷却后4 000 r/min离心10 min，取上清，于268 nm波长处测定吸光值(A268)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 鸢尾苷元对辐照小鼠状态和脏器指数的影响

小鼠接受4Gy的X射线照射后，于第4-5 d出现活动度降低，皮毛散乱、光泽性差。9-10天后状态逐渐改善，各组均无辐照相关死亡。辐照组小鼠脾指数和胸腺指数均显著低于正常对照组。脾指数以照射后7 d最低，随后逐渐恢复，各鸢尾苷元给药组下降幅度较模型组减轻，且恢复较快。第7、14、21 d与模型组比较具有显著性差异，随着给药剂量的增加脾指数有增加趋势，但各剂量组间无显著差异；至第28 d各辐照组均明显恢复，与正常组比较中、高剂量给药组呈增生趋势，高剂量组有统计学意义，见表1。胸腺指数在辐照后第7 d即显著低于正常组，并呈进行性下降，辐照后第21 d降幅最大，至第28 d有所恢复，但仍显著低于正常组。鸢尾苷元可减轻其下降程度，与模型组比较，高剂量给药组各时间点均有显著差异，中剂量组在第14、21、28 d差异具有显著性，而低剂量组只有第14 d差异显著，并且第28 d高剂量组的胸腺指数显著高于低剂量组(P<0.05)，见表2。

表1 鸢尾苷元对辐照小鼠脾指数的影响

表2 鸢尾苷元对辐照小鼠胸腺指数的影响

2.2 鸢尾苷元对辐照小鼠外周血象的影响

结果如表3-6所示，X线4Gy辐照可导致小鼠外周血象WBC、RBC、PLT数量和HGB浓度不同程度下降，其中以WBC降低幅度最为显著，与对照组比较，模型组第7 d降幅达98.9%，然后逐渐回升，但至第28d降幅仍达58.2%。鸢尾苷元各剂量组使其下降幅度减轻，第7 d时分别降低79.2%、75.6%和71.1%，并促进回升，至第28 d较正常组下降分别为43.1%、36.9%和37.9%，仍显著低于模型组的58.5%(P<0.05)。其次是PLT，虽然辐照第7 d即显著低于正常对照组，但以第14 d降幅最大，模型组较对照组降低68.7%，各给药组呈现一定的保护作用，至第21 d与正常组比较已无显著性差异，高剂量组起效更早，作用更强。RBC数量和HGB浓度照射后亦显著低于正常对照组，第14 d最明显，但下降幅度较小。接受辐照小鼠虽然各时间点的RBC均显著低于正常对照组，模型组降幅最大，但只有32.3%，随后逐渐恢复，表明辐照对红系影响相对较轻。各剂量给药组虽降幅有减轻趋势，与模型组比较，只有高剂量组有显著差异。HGB下降幅度更小，最大降幅为26.2%，恢复较RBC快，至第21 d与正常组比较，中、高剂量组无显著差异，第28 d各辐照组均无显著差异。给药组各时间点虽均高于模型组，但只有鸢尾苷元高剂量组在第21 d与模型组比较有显著差异。

表3 鸢尾苷元对辐照小鼠外周血WBC的影响

表4 鸢尾苷元对辐照小鼠外周血PLT的影响

表5 鸢尾苷元对辐照小鼠外周血RBC的影响

表6 鸢尾苷元对辐照小鼠外周血HGB的影响

2.3 鸢尾苷元对辐照小鼠BMNCs数的影响

照射后小鼠 BMNCs 数减少,造血系统明显抑制。与模型组比较,鸢尾苷元各剂量组的BMNCs数一直保持较高水平， 第7 d、14 d均有统计学差异，第21 d，只有中、高剂量组差具异有显著性，至第28 d各辐照组基本恢复正常。表明鸢尾苷元能促进辐射损伤小鼠骨髓造血功能的恢复,见表7 。

表7 鸢尾苷元对辐照小鼠BMNCs 的影响(×106/股骨，

2.4 鸢尾苷元对辐射小鼠骨髓DNA含量的影响

小鼠股骨骨髓 DNA含量的变化如表8所示，辐照后骨髓DNA含量显著降低(P<0.01)，以辐照后第7 d降幅最大，直到第28 d仍显著低于正常对照组。鸢尾苷元各剂量组的降幅减小，并显著高于模型组，表明鸢尾苷可以减轻辐射所致小鼠骨髓 DNA的损伤，并促进其恢复。

表8 鸢尾苷元对辐照小鼠骨髓 DNA含量的影响

3 讨论

3.1 辐照对小鼠造血系统的影响

造血系统具有不断增殖和快速更新的特点，是电离辐射高度敏感组织。机体遭受辐射损伤后，最早出现的变化就是血液学改变。造血系统损伤程度和恢复速度可作为放射性疾病病情和转归的评估指标[11]。本研究发现，小鼠接受4Gy X线照射后，外周WBC数量和骨髓DNA含量变化最为敏感，发生得早，第7 d即达最低值，且降低幅度大，恢复缓慢，直到第28 d仍显著低于正常对照组。其次为PLT，第14 d降幅最大。红系损伤相对较轻，并且恢复较快。脾脏是参与机体造血及免疫调节的重要器官，也是辐射高度敏感的器官之一。辐照后可见脾脏体积缩小和重量减轻，但恢复较快，至第28 d基本恢复正常。胸腺虽为免疫器官，同时也是培育T淋巴细胞的场所，是重要造血器官。当机体受辐照后胸腺质量的降低也是反映造血损伤程度的客观指标。胸腺指数虽然照射后第7 d即显著低于正常对照组，但有进行性加重的倾向，至第21 d最低，第28 d各辐照组虽有所恢复，但仍显著低于正常，表明辐射对胸腺的损伤更加持久。

3.2 鸢尾苷元对辐照小鼠的防护作用

电离辐射除引起生物分子激发、电离和化学键断裂外，还可导致机体内水分分解，产生大量自由基，造成生物大分子和生物膜损伤。因此，辐射损伤重要原因就是大量自由基产生导致的氧化损伤[12]。异黄酮是多酚化合物，具有抑制活性氧(ROS)产生、淬灭自由基、减少DNA和膜脂质氧化损伤、提高抗氧化酶活性等抗氧化应激及抗辐射损伤作用[3,13]。鸢尾苷元为三羟基异黄酮，多酚羟基是其具有抗氧化活性的结构基础；其4′,7位羟基结构与乙烯雌酚相似，具有雌激素活性。本研究显示鸢尾苷元可显著减轻X线辐射损伤小鼠WBC、PLT、RBC、骨髓有核细胞数和DNA含量的降低程度，并促进其恢复，对脾脏指数和胸腺指数也有促进恢复的作用，且有剂量依赖倾向，高剂量组效果更明显。表明鸢尾苷元可以减轻辐射对小鼠造血系统和免疫系统的损伤，具有辐射损伤防护作用，其作用机制考虑与其抗氧化损伤和植物雌激素活性有关，有待进一步探索。

3.3 小鼠心脏采血法

外周血象是评价辐射损伤的重要指标，采用全自动血球分析仪检测全血更为客观准确，但血液样本用量较大。小鼠是辐射损伤最常用的实验动物，采血较难，眼球取血、断头取血是其常用的采血方法，不仅取血量少，而且容易引起溶血和凝血。本研究将小鼠麻醉后开腹，剪开膈肌暴露心脏(避免打开胸腔引发出血)。采用EDTA-K2冲洗后的5 ml注射器，从右心室负压进针抽血，可确保采血量达1 ml以上，然后置于EDTA-K2抗凝管中轻摇后再行检测，可以满足检测需要。小鼠心脏取血简便易行，采血量多，准确可靠。

综上所述，以小鼠为实验动物，X线4Gy可导致造血系统明显损伤且无相关死亡。实验周期短，费用低，可用于防治辐射损伤药物的筛选。鸢尾苷元可以减轻辐射对小鼠造血系统的损伤，具有防护作用。但因动物小，不能多次采集样本，因此不能动态观察同一个体外周血象及骨髓的变化。由于个体差异的存在，对辐射损伤实验结果分析判断有一定的影响。