HP-OMVs对2型糖尿病患者大动脉内皮细胞LR11及动脉硬化危险因子表达水平的影响

张艳彦，晁 珂，金文龙

(延边大学附属医院 内分泌科,吉林 延吉133000)

有研究表明，高胆固醇血症、冠心病、2型糖尿病患者血清LR11水平增加，与糖代谢紊乱的生化指标(空腹血糖、HbA1c)及动脉粥样硬化危险因素(年龄、LDL-C、颈动脉IMT)相关[1-5]，在动脉粥样硬化动物模型的动脉斑块内膜平滑肌细胞中的表达增高[6]。一些流行病学、血清学、组织病理学及临床研究等提示幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,HP)感染与动脉硬化相关[7]，亦有研究认为两者不相关[8]。本实验探讨幽门螺杆菌外膜泡对2型糖尿病患者大动脉内皮细胞的LR11及动脉硬化危险因子表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 HP培养和HP-OMVs的提取

从哥伦比亚-脑心浸液固体培养基挑取单克隆幽门螺杆菌菌株(美国ATCC43504)活化制备种子液，并扩大培养(5% O2、10% CO2和85% N2；37℃、120 rpm)，培养4天待菌液OD600≈1时，收集菌液，10 000 rpm离心收集上清，用0.45 μm滤头过滤去除杂质，用胞外囊泡分离试剂盒(exoEasy Maxi Kit，Qiagen，76064)收集胞外囊泡，-20℃保存备用。20 μl胞外囊泡液滴加到200目铜网表面，3-5 min后吸干残余液体，再滴加20 μl 4%戊二醛溶液在室温固定3-5 min，再用滤纸吸干残余液体，用生理盐水洗涤1次，室温晾干，再滴加20 μl 2%磷钨酸钠，室温染色3-5 min，吸干残余液体，用生理盐水洗涤1次，最后在电镜下观察HP-OMVs呈圆泡形，大小各异，直径在50-200 nm之间(图1)。囊泡浓度：采用BCA法(碧云天，试剂盒由中国上海Beyotime Biotechnology提供)检测囊泡蛋白浓度。

图1 HP-OMVs电镜观察

1.2 细胞培养

D-HAEC原代细胞株购自美国Lonza公司，进行复苏、培养、传代。实验中使用第4代细胞、美国Thermo Fisher Scientific细胞培养箱(5%CO2、37℃)及Lonza EGM-2血管内皮细胞培养基(CC-3162)。

1.3 细胞增殖检测

培养D-HAEC 24 h，更换90 μl EGM-2培养基，加入10 μl不同浓度(2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml、10 μg/ml)HP-OMVs，对照组加入等体积PBS。取出96孔板，每孔加入CCK-8试剂10 μl，37℃孵育2 h，使用CCK-8试剂盒(日本株式会社同仁化学研究所，Dojindo)，在450 nm处检测吸光度(美国BioTek仪器有限公司Gen5酶标仪)并计算细胞活力，实验重复5次。

1.4 分组

实验分为4组，C组(对照组，即Control组，无HP-OMVs和SQ22536)，HP组(有HP-OMVs，无SQ22536)，CS组(无HP-OMVs，有SQ22536)，HPS组(有HP-OMVs和SQ22536)。6孔板铺设D-HAEC(Passage 4)，HP组和HPS组加入HP-OMVs共同培养24 h后，CS组和HPS组加入腺苷酸环化酶抑制剂(SQ22536)作用30 min，之后提取细胞总RNA。每组n=6。

1.5 Real-time PCR

从QIAGEN公司购买Rneasy Plus Mini Kit、QuantiNova Rev Transcription Kit、QuantiNova SYBR Green PCR Kit，培养D-HAEC，提取细胞总RNA，合成cDNA，实时荧光定量PCR测定LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表达水平。引物产品号:LR11(PPH06225A)，IL-1β(PPH00171C)，IL-6(PPH00560C)，MCP-1(PPH00192F)，TNF-α(PPH00341E)，VCAM-1(PPH00623E)。

1.6 统计分析

采用SPSS16.0统计学软件，进行ANOVA分析、Pearson相关分析及多元逐步回归分析，P<0.05示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HP-OMVs促进D-HAEC的增殖

HP-OMVs(浓度2.5、5.0、7.5、10 μg/ml)与D-HAEC共同培养24 h，用CCK-8检测细胞活力，随HP-OMVs浓度的增加而D-HAEC数逐渐增多，HP-OMVs浓度7.5 μg/ml、10 μg/ml时，增殖率达125%、128%，与对照组比较有显著性差异(图2)。本实验采用7.5 μg/ml浓度进行后续实验。

图2 CCK-8检测细胞活力

2.2 LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表达

HP组与C组比较，HP-OMVs可显著增高D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表达水平，当加入腺苷酸环化酶阻滞剂(SQ22536)时，HPS组D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表达水平被显著抑制(表1)。Pearson相关性分析(表2)示LR11与IL-1β、IL-6、VCAM-1呈显著正相关，与TNF-α有相关趋势，多元逐步回归分析示LR11与IL-1β最密切相关(表3)。

表1 各组间LR11及其他动脉硬化危险因素表达水平的比较

表2 LR11与其他动脉硬化危险因素的相关性

表3 LR11与其他动脉硬化危险因素的多元逐步回归分析

3 讨论

幽门螺杆菌外膜泡分泌的细胞毒素相关基因A(CagA)和空泡毒素A(VacA)毒力非常强，可引起强烈的炎症反应[9]。有研究报道，HP感染与糖尿病的发生发展有关，引起胰岛素抵抗[10]，增加炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表达[11]，促进大血管动脉硬化发生发展[12]。本实验研究中，HP-OMVs刺激的D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1表达水平显著增加，多因素分析示LR11与IL-1β、IL-6、VCAM-1呈显著正相关(r=0.967、0.733、0.683)，多元逐步回归分析示LR11与IL-1β关系最密切(B=0.046，t=7.064，P<0.01)。并且，腺苷酸环化酶阻滞剂(SQ22536)可显著下调HP-OMVs刺激的D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1表达水平，以上研究结果示幽门螺杆菌感染可能通过调控cAMP信号通路增高LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表达水平，促进糖尿病大血管动脉硬化的发生发展，其中，IL-1β可能是影响LR11的主要因素。另外，有研究报道LR11可调控血管平滑肌细胞的增值、迁移，在本研究中观察到HP-OMVs与2型糖尿病患者大动脉内皮细胞共同培养时促进细胞增殖，这是否与LR11调控血管平滑肌细胞增值、迁移的作用有关尚不清楚。我们的前期临床研究结果提示血清LR11水平与2型糖尿病及颈动脉IMT相关[13-15]。幽门螺杆菌与冠心病风险相关性荟萃分析示[16]，幽门螺杆菌可增加冠心病早期发展的风险，尤其是在普通人群中，而其后期影响可能被其他动脉硬化相关危险因素所削弱，其中最主要的影响因素是年龄。多项HP与动脉硬化相关性研究存在着争议的原因可能为各项研究未能分层分析年龄因素。我们的研究结果显示HP与动脉硬化相关，因此HP的防治有可能会降低2型糖尿病患者大血管动脉硬化发生发展的风险。