Lnc RNA PCGEM1对鼻咽癌细胞SUNE-1辐射敏感性的影响

金爱燕，李立萍，朱 虹，高春成，左文娜，王洪芹

(沧州市中心医院 耳鼻喉科，河北 沧州061000)

鼻咽癌是头颈部最为常见的肿瘤类型，发病率逐年递增，具有隐匿性强、进展缓慢的特点[1]。大多数晚期鼻咽癌患者经放射治疗后仍会复发或转移[2]。文献报道[3]，鼻咽癌的发生和癌基因的活化表达相关，因此揭示鼻咽癌相关的基因和调控机制对治疗鼻咽癌具有极其重要的意义。长链非编码RNA(long-chain noncoding RNA，lnc RNA)曾被认为不发挥实际作用，近年来有研究发现，其在肿瘤细胞周期、肿瘤细胞侵袭转移与化疗耐药等相关的信号通路方面均发挥调节作用[4]。作为lnc RNA家族成员之一，非编码RNA(anti-differentiation noncoding RNA，Lnc RNA)PCGEM1已被证实在多种疾病的发生发展过程中具有分化调控的作用[5]。鼻咽癌的发生发展中有诸多非编码RNA、抑癌基因、促癌基因及蛋白因子的参与，但目前关于PCGEM1在鼻咽癌中的作用研究报道甚少，其是否能够调节鼻咽癌细胞的放疗敏感性尚不清楚。因此，本研究通过对鼻咽癌组织和细胞株的研究，探讨PCGEM1对鼻咽癌细胞辐射敏感性的分子机制，为新型靶向药物的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集2016年1月-2018年6月经放射治疗失败后于我院接受手术治疗的95例鼻咽癌患者癌组织及距离癌组织超过2 cm处的正常组织，用以上组织构建鼻咽癌组织芯片，在免疫组织化学染色后共15例组织标本出现不同程度缺失，剩余80例标本经组织病理学检测证实为原发性鼻咽癌，并纳入研究，患者年龄38-72岁，中位年龄51岁。所有患者均同意本研究并签署知情同意书，且经我院伦理委员会审核批准后收集标本。

1.2 细胞及主要试剂和仪器

鼻咽癌细胞株SUNE-1购自美国模式培养物保藏所(ATCC)，siPCGEM1及阴性对照netative control(NC)干扰片段，miR148a、PCGEM1及U6引物均由上海吉玛制药技术有限公司设计完成。DMEM培养基(D777)；SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒(QPK-201)于TOYOBO采购；X射线生物辐照仪购自Thermo；Trizol reagent(9009)采购自TaKaRa；Transwell小室采购自BD；MTT试剂盒购自碧云天；γH2AX、TGF、Smad抗体购自博泰恒通。苏净Airtech超净工作台；SANYO MCO-15AC细胞培养箱；Nikon Ti-U/Ti-s倒置荧光显微镜；5810R 型高速离心机；Roche R480实时荧光定量PCR仪。

1.3 细胞转染

调整鼻咽癌细胞株SUNE-1细胞株浓度至1×106个/ml，取2 ml接种于6孔板中，培养过夜，采用Lipofectamine 2000将浓度均为100 nmol/L的siPCGEM1和阴性对照转染至细胞，以SUNE-1作为空白对照，得到SUNE-1-siPCGEM1及SUNE-1-NC细胞株。

1.4 qRT-PCR检测Lnc RNA PCGEM1的表达

采用Trizol法提取各组细胞总RNA并进行反转录，按照PrimeScrip反转录试剂盒进行反转录成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq说明书配置PCR反应体系，反应条件为：95℃预变性10 min，然后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40 个循环；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。U6作为内参(上游引物为 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物为 5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)，Lnc RNA PCGEM1(上游引物为 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)，miR-148a(上游引物为 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)，miR-148a(上游引物为 5’-CCCAACCCTTGTAACTGTCT-3’，下游引物为5’-TCCGAGGTGTGCAGGG-3’)，相对表达量用2-△△CT表示。每个样本独立重复实验3 次。

1.5 MTT实验检测细胞增殖

细胞SUNE-1、SUNE-1-NC及SUNE-1-siPCGEM1经5 Gy电离辐射照射后，按照每孔500-1000 个密度铺至96 孔板，轻轻混匀后，置入37℃培养箱继续培养，每孔加MTT溶液20 μl，37℃避光4 h 后，弃掉孔内液体，再加DMSO各100 μl，置于37℃摇床上快速振荡15 min，以便充分溶解结晶物，最后将96 孔板置于酶标仪上检测 492 nm 处的OD值。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭

实验前12 h更换为无血清培养基，细胞SUNE-1、SUNE-1-NC及SUNE-1-siPCGEM1经10 Gy电离辐射照射后，将40 μl matrigel基质胶铺于Transwell小室中，消化细胞并用1x PBS清洗2遍，将500 μl 完全培养基加入24 孔板，细胞计数，取5×105细胞重悬，向Transwell小室中加200-250 μl 细胞悬液，保证下层完全培养基与Transwell小室间无气泡。置于培养箱内正常培养 24 h，加用甲醇配制、PBS 稀释的0.1%结晶紫染液500 μl进行染色，室温避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室内部，倒置晾干，置于倒置荧光显微镜下观察显穿过膜的细胞并拍照计数。

1.7 划痕实验检测细胞迁移

实验前12 h更换为无血清培养基，细胞SUNE-1、SUNE-1-NC及SUNE-1-siPCGEM1经10 Gy电离辐射照射后，调整细胞浓度，以5×104个/孔接种于24孔培养板中，用10 μl sterile pipette 枪头沿直线做划痕，加入100 μl PBS将细胞碎片冲洗掉，然后无血清培养基，37℃、5%CO2温箱培养，分别于0 h和24 h在倒置显微镜下观察细胞运动情况以及划痕宽度，计算细胞迁移的距离和细胞迁移率。

1.8 免疫荧光标记

细胞SUNE-1、SUNE-1-NC及SUNE-1-siPCGEM1经10 Gy电离辐射照射后，分别于0 h、6 h进行免疫荧光检测，将细胞贴附于载玻片上，PBS清洗后，4% 多聚甲醛固定室温下固定 15 min，再经0.1Triton X-100室温通透细胞20 min，2%羊血清室温封闭1 h，加入γH2AX一抗，4℃下孵育过夜，再加入二抗室温孵育1 h，经DAPI核染色后共聚焦显微镜拍照并记录细胞中绿色γ-H2AX foci数量。

1.9 生物信息学预测

使用生物信息学网站starBase预测PCGEM1可互补结合的微小RNA(microRNA，miRNA)。

1.10 荧光素酶基因报告分析

通过miRBase数据库获得人的PCGEM1基因序列，以HNEC细胞基因组DNA为模板，采用PCR扩增PCGEM1的3′-非翻译区序列，构建至荧光素酶报告基因载体psi-CHECK中，记为野生型lncRNA PCGEM1-wild，同时构建突变型重组质粒lncRNA PCGEM1-mutant。将HEK293T 细胞按30%左右密度铺24 孔板，将miRNA-148a mimic及mimic control分别与空载质粒、野生型lncRNA PCGEM1-wild及突变型lncRNA PCGEM1-mutant共转染至HEK293T细胞，分为空白组、野生组和突变组。转染后24 h，根据双荧光素酶测定试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.11 统计学分析

数据统计采用SPSS 19.0软件，作图工具采用Graphpad5.01，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 Lnc RNA PCGEM1在不同组织中的表达

RTFQ-qPCR结果显示，鼻咽癌组织中 Lnc RNA PCGEM1的表达水平高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 Lnc RNA PCGEM1在不同组织中的表达

2.2 Lnc RNA PCGEM1表达与鼻咽癌患者临床病理特征的相关性

统计收集的80例鼻咽癌患者的临床病理资料，分析临床病理特征与lnc RNA PCGEM1表达的相关性，以所收集数据总体水平的70%作为lnc RNA PCGEM1高、低表达水平的分界线，结果显示lnc RNA PCGEM1表达水平与患者性别、年龄、肿瘤直径无关(P>0.05)，分化程度越低，临床分期越晚，淋巴结发生转移的患者lnc RNA PCGEM1表达水平越高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 Lnc RNA PCGEM1表达与鼻咽癌患者临床病理特征的相关性

2.3 细胞系构建

qRT-PCR结果显示SUNE-1组和SUNE-1-NC组Lnc RNA PCGEM1的表达无统计学意义(P>0.05)，SUNE-1-siPCGEM1组细胞中Lnc RNA PCGEM1的表达量明显低于空白对照组和阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.001)，提示成功构建 PCGEM1沉默细胞系，见图2。

图2 各细胞中Lnc RNA PCGEM1相对表达量

2.4 Lnc RNA PCGEM1对鼻咽癌细胞株SUNE-1辐射敏感性的影响

MTT实验结果显示，与SUNE-1组和SUNE-1-NC组相比，SUNE-1-siPCGEM1组经电离辐照后OD492 nm值明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。说明Lnc RNA PCGEM1被沉默后，能增强鼻咽癌细胞SUNE-1的辐照敏感性，见图3。

图3 MTT法检测Lnc RNA PCGEM1对SUN-1放射敏感性的影响注：与SUNE-1比较， *P<0.05；与SUNE-1-NC比较， #P<0.05

2.5 Lnc RNA PCGEM1对电离辐照诱导的鼻咽癌细胞株SUNE-1侵袭能力的影响

Transwell实验显示，相比SUNE-1组和SUNE-1-NC组，电离辐照后，SUNE-1-siPCGEM1细胞通过matrigel基质胶的数量明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。该结果表明沉默Lnc RNA PCGEM1后，抑制鼻咽癌细胞电离辐射后的侵袭能力，见图4。

图4 Lnc RNA PCGEM1对电离辐射诱导SUNE-1侵袭能力的影响

2.6 Lnc RNA PCGEM1对电离辐照诱导的鼻咽癌细胞株SUNE-1迁移能力的影响

细胞划痕实验结果，相比SUNE-1组和SUNE-1-NC组，电离辐照后，SUNE-1-siPCGEM1组细胞迁移率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。该结果表明沉默Lnc RNA PCGEM1后，抑制鼻咽癌细胞电离辐射后的迁移能力，见图5。

图5 Lnc RNA PCGEM1对电离辐射诱导SUNE-1迁移能力的影响

2.7 Lnc RNA PCGEM1对鼻咽癌细胞株SUNE-1电离辐射诱导DNA 损伤的影响

免疫荧光结果显示，相比SUNE-1组SUNE-1和SUNE-1-NC组，SUNE-1-siPCGEM1组细胞γH2AX的荧光强度更高，异具有统计学意义(P<0.05)。该结果表明沉默Lnc RNA PCGEM1后，抑制鼻咽癌细胞电离辐射后的DNA损伤的修复作用，见图6。

图6 Lnc RNA PCGEM1对电离辐射诱导的SUNE-1 DNA损伤的影响

2.8 Lnc RNA PCGEM1与miR-148a的作用关系

经starbase数据库分析发现PCGEM1和miR-148a之间有互补结合序列，推测两者可能具有靶向调控关系。双荧光素酶报告基因结果显示，转染miR-148a后，野生型PCGEM1的荧光素酶活性被抑制(P<0.05)，突变型PCGEM1的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)，说明PCGEM1和miR-148a具有靶向调控关系，见图7A、7B。

图7A Starbase数据库预测结果

图7B 荧光素酶报告基因测定结果

2.9 miR-148a在不同细胞中的表达

qRT-PCR检测稳转干扰细胞系和空白细胞对照中miR-148a结果表明，相比SUNE-1组和SUNE-1-N组lnc RNA PCGEM1被沉默后，miR-148a表达水平显著上调(P<0.05)，证实lnc RNA PCGEM1可以特异性结合miR-148a并发挥负向调控作用，见图8。

图8 不同细胞中miR-148a相对表达量

3 讨论

目前关于Lnc RNA在肿瘤中的作用仅有一小部分被透彻研究，有些Lnc RNA在肿瘤中的表达异常改变，功能类似于癌基因或抑癌基因[6]，可通过参与调控细胞周期，影响癌症的发生发展。目前，尚无标志性Lnc RNA可以直接预测BUCC，但Lnc RNA PCGEM1在前列腺癌中特异性表达已由Srikantan等证实，该基因位于染色体2q32位点上[7]。Zhang等人[8]采用RT-PCR检测发现PCGEM1在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织。另有研究表明[9]在胰腺癌患者癌组织和血清中，Lnc RNA PCGEM1的表达量上升。有学者称[10]，Lnc RNA PCGEM1在鼻咽癌中表达水平明显升高。本研究采用RT-PCR检测其在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达发现，在鼻咽癌组织中表达水平明显高于正常组织，与上述研究结果相符。统计分析lnc RNA PCGEM1表达与患者临床病理特征的相关性发现，分化程度越低，临床分期越晚，淋巴结发生转移的患者lnc RNA PCGEM1表达水平越高，推测lnc RNA PCGEM1可能是癌分子。

研究表明[11]，胰腺癌细胞中沉默Lnc RNA PCGEM1可促进 CDK1激酶与 EZH2 结合，使EZH2的苏氨酸Thr-345和Thr-487处磷酸化增加，最终导致EZH2的泛素化降解。Peng等[12]发现，下调Lnc RNA PCGEM1表达可抑制结直肠癌的侵袭及迁移。据报道[13]，在辐射诱导的癌细胞模型中，Lnc RNA PCGEM1的表达水平出现异常升高，提示Lnc RNA PCGEM1的表达与癌细胞经电离辐射后的应激反应有关。本研究结果显示，电离辐射照射后，沉默Lnc RNA PCGEM1的鼻咽癌细胞株SUNE-1增殖和迁移能力明显受到抑制，提示沉默Lnc RNA PCGEM1能够增强鼻咽癌辐射敏感性。电离辐射可引起肿瘤细胞DNA双链断裂，不能修复的DNA损伤会介导细胞凋亡而被清除，γH2AX作为DNA双链断裂的标志物，可有效反映DNA损伤程度[14]。本研究结果中，沉默Lnc RNA PCGEM1后肿瘤细胞γH2AX表达明显高于对照组，提示抑制Lnc RNA PCGEM1的表达可加剧DNA损伤或降低DNA损伤的修复能力。以上结果表明，Lnc RNA PCGEM1在鼻咽癌的发生发展过程中发挥重要调节作用，有望作为该病的治疗及预后的标志因子。

微小RNA(MicroRNA，miRNA) 是存在于真核生物中一类长度为18-25nt的非编码单链小分子RNA，其作用机理主要是直接结合在特定的靶信使RNA的3′非转录区，促使靶RNA发生降解或者翻译被抑制，从而调控目的基因的表达[15]。越来越多研究发现，种类繁多的miRNA家族成员与人类多种疾病及肿瘤的发展密切相关[16]。miR-148a基因位于人类染色体的12q22n上，相关研究证实，miR-148a对前列腺癌、胃癌、结直肠癌及宫颈癌均发挥抑制作用，但在肝癌中促进细胞增殖及转移进而起到促癌作用，在淋巴细胞白血病中，miR-148a表达异常且参与细胞增殖及迁移[17]。Lnc RNA PCGEM1调控鼻咽癌的发生发展过程中是否有miR-148a参与鲜有报道。lnc RNA对不同细胞具有多向调节功能，因而在诸多人类疾病中发挥重要作用，有研究证实了mRNA和lnc RNA之间一种新的调控机制，即两者的相互影响跟它们竞争共同的miRNA反应元件有关，此时lnc RNA可能发挥了竞争性内源性RNA的作用，对miRNA进行吸附并调控其靶标，从而使转录后调控水平进一步增加[18]。本研究同时采用starbase数据库对Lnc RNA PCGEM1的靶基因进行预测，分析发现Lnc RNA PCGEM1和 miR-148a之间存在一定的结合位点，由此推测miR-148a可作为Lnc RNA PCGEM1的下游靶基因。此外采用荧光素酶报告基因实验检测miR-148a与全Lnc RNA PCGEM1转录本的结合能力，发现两者能形成一定的互补碱基对，进一步证实了两者的靶向关系。qRT-PCR检测发现，鼻咽癌细胞中沉默Lnc RNA PCGEM1后，miR-148a表达水平显著上调，证实Lnc RNA PCGEM1对miR-148a发挥负向调控作用。以上结果表明，在鼻咽癌中Lnc RNA PCGEM1可能通过特异性结合并抑制miR-148a的表达进而增加鼻咽癌细胞辐射敏感性。

综上，Lnc RNA PCGEM1在鼻咽癌中呈高表达，与分化程度、临床分期、淋巴结是否发生转移相关。沉默Lnc RNA PCGEM1表达可能通过上调miR-148a水平增加鼻咽癌细胞辐射敏感性，从而抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭能力，但具体机制有待进一步研究。