双香豆素通过抑制PDK1活性增加人胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的研究

周 磊，熊 壮，马 跃，董敬蓉，丁文斌

(长春中医药大学附属医院，吉林 长春130021)

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见原发性肿瘤。由于恶性胶质瘤患者多为青壮年，且缺乏有效的综合治疗措施，因此预后很差。替莫唑胺作为基础化疗药物广泛应用于恶性胶质瘤临床治疗中[1]。替莫唑胺是一种新型烷化剂，通过细胞毒作用发挥抗肿瘤效果，较传统细胞毒药物不良反应小，患者耐受性好。限制替莫唑胺治疗效果的主要原因在于细胞毒药物的剂量限制性毒性，因此如何增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性一直是抗肿瘤化疗研究的重点和难点。

恶性肿瘤细胞特征性的代谢模式为有氧糖酵解，也称为Warburg效应，而逆转Warburg效应导致肿瘤细胞代谢重编程，是重要的抗肿瘤治疗靶点之一。丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)可通过磷酸化负调节丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)活性，进而影响肿瘤细胞能量代谢[2]。很多研究发现，PDK1在多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤细胞的侵袭、耐药、恶性进展中密切相关。双香豆素作为临床用药，具有抗凝、抗肿瘤和抗菌的多重药效学作用。且已有研究表明，双香豆素具有抑制PDK1活性的作用[3]。因此，本研究以人胶质瘤U87细胞为模型，探讨双香豆素是否通过抑制PDK1活性进而影响肿瘤细胞代谢模式，以提高U87细胞对替莫唑胺的敏感性。

1 材料与方法

1.1 细胞

人脑星形胶质母细胞瘤U87MG细胞来自吉林大学基础医学院病理生理学系实验室。U87MG细胞常规培养条件培养于含有10%FBS(Hyclone，美国)的DMEM培养基(Gibco，美国)中，置于37℃、5% CO2培养箱。

1.2 细胞存活率实验(Cell Viability Assays)

U87MG细胞接种于96孔板中，8 000细胞/孔。不同浓度替莫唑胺作用24 h后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)孵育4 h后，弃去培养液，加入150 μl DMSO，室温振荡 10 min，全自动酶标仪(波长 490 nm)测定各孔 A值，计算细胞存活率。

1.3 免疫印迹

冷RIPA裂解液裂解细胞。全细胞裂解液使用Bio-Rad蛋白试剂测定蛋白浓度。每样本取约50 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，湿转法到PVDF膜上，封闭后按照1∶1 000加入特异性一抗，4℃孵育过夜，洗脱后加入HRP标记的二抗，ECL发光法检测目的蛋白表达情况。

1.4 葡萄糖摄取和乳酸生成检测

细胞加药处理后，PBS清洗后，加入新鲜培养液。收集培养液，分别用葡萄糖和乳酸检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)检测培养液中葡萄糖和乳酸浓度，用细胞总蛋白定量。

1.5 统计学分析

实验重复3次，数据使用平均值±标准误(mean±SE)表示。使用one-way ANOVA进行统计学检验，分析软件为SPSS 12.0，P<0.01有统计学意义。

2 结果

2.1 双香豆素与替莫唑胺对U87MG细胞存活率的影响

根据文献及本研究组的前期工作，采用双香豆素浓度为25 μmol/L，分别联合替莫唑胺浓度为100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L作用于U87MG细胞24 h，MTT法检测细胞存活率。结果显示，双香豆素与替莫唑胺联合作用对U87MG细胞存活率抑制明显高于单独替莫唑胺作用组，特别是替莫唑胺浓度为200 μmol/L时，与双香豆素合加具有明显的协同作用(图1，P<0.01)。所以后续实验中选用替莫唑胺浓度为200 μmol/L，双香豆素浓度为25 μmol/L。

*P<0.01图1 双香豆素与替莫唑胺对U87MG细胞存活率的影响

2.2 双香豆素与替莫唑胺对U87MG细胞PDK1活性的影响

PDK1是葡萄糖代谢途径中的关键酶，在糖酵解中发挥重要作用。PDK1通过磷酸化PDH的ser232位点，降低PDH活性，因而抑制丙酮酸的脱羧氧化生成乙酰辅酶A进入线粒体的过程，促进Warburg效应和肿瘤的生长。免疫印迹法检测PDK1靶蛋白PDH及磷酸化PDH的ser232位点(p-PDHE1A)的表达变化，结果显示与对照组相比，TMZ组p-PDHE1A无明显变化，但DIC组和TMZ+DIC组p-PDHE1A表达明显降低(图2)。

图2 双香豆素与替莫唑胺对U87MG细胞PDK1活性的影响

2.3 双香豆素与替莫唑胺对U87MG细胞葡萄糖摄取的影响

为进一步探讨双香豆素影响U87MG细胞对替莫唑胺敏感性的机制，我们检测了葡糖糖代谢相关指标葡萄糖摄取和乳酸生产量。葡萄糖摄取结果显示，与对照组相比，TMZ组葡萄糖摄取增高，而DIC组葡萄糖摄取降低，特别是TMZ+DIC组与TMZ组相比，葡萄糖摄取明显降低(图3，P<0.01)。

*P<0.01图3 双香豆素与替莫唑胺对U87MG细胞葡萄糖摄取的影响

2.4 双香豆素与替莫唑胺对U87MG细胞乳酸生成的影响

乳酸生成结果显示，与对照组相比，TMZ组乳酸生成增高，而DIC组乳酸生成降低，特别是TMZ+DIC组与TMZ组相比，乳酸生成明显降低(图4，P<0.01)。

*P<0.01图4 双香豆素与替莫唑胺对U87MG细胞乳酸生成的影响

3 讨论

恶性胶质瘤预后不佳，特别是化疗抵抗是其难以治愈的根本原因之一。恶性胶质瘤细胞可通过致癌信号的激活及不同代谢机制异常导致其对化疗治疗敏感性降低[4]。神经胶质瘤能量代谢依赖于Warburg效应，即有氧糖酵解。PDK1可通过磷酸化负向调节丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)，导致PDC失活促进Warburg效应。最新研究证实，PDK1表达与活性受癌基因调节，在多种癌症中过表达，并在癌细胞代谢中发挥重要作用。

PDK1在肿瘤组织中的高表达与肿瘤中异常糖酵解密切相关，因此，抑制PDK1可作为抗肿瘤治疗的新靶点。关于PDKs抑制剂的研究较多，但因具有抗癌疗效时剂量过大或者选择性抑制较差等造成毒副作用较大等问题，限制其在临床上的应用[5]。Zhou等利用Discovery Studio 3.5软件的Libdock模块虚拟筛选并分析了双香豆素与PDK1的可能结合位点，并在一系列细胞内外实验中验证了双香豆素抑制PDK1活性的效果[6]。此外，Zhang和Xu等在体内外实验中进一步验证了双香豆素可通过抑制PDK1活性进而达到抗卵巢癌作用和增加肝癌细胞化疗敏感性的作用[3,7]。

胶质母细胞瘤中PDK1高表达，且其磷酸化水平与患者的不良预后呈正相关。因此，本研究以人胶质瘤U87MG细胞为模型，探讨双香豆素是否可以提高U87MG细胞对替莫唑胺的敏感性。基于文献报道与本研究组的前期工作，我们选用双香豆素浓度为25 μmol/L，经免疫印迹实验证实该浓度对U87MG细胞中PDK1的活性具有很好的抑制效果。而双香豆素与替莫唑胺联合作用可明显增加U87MG细胞对替莫唑胺的敏感性。为进一步探讨双香豆素如何发挥化疗增敏作用，我们利用免疫印迹法检测PDK1靶蛋白PDH及磷酸化PDH的ser232位点(p-PDHE1A)的表达变化，表明双香豆素单独或与替莫唑胺联合作用于U87MG细胞均可有效抑制PDK1活性，而替莫唑胺单独作用无明显效果。PDK1是葡萄糖代谢途径中的关键酶，在糖酵解中发挥重要作用。PDK1通过磷酸化PDH的ser232位点，降低PDH活性，因而抑制丙酮酸的脱羧氧化生成乙酰辅酶A进入线粒体的过程，促进Warburg效应和肿瘤的生长。我们在此基础上，检测了葡糖糖代谢相关指标葡萄糖摄取和乳酸生产量。替莫唑胺单独作用可引起U87MG细胞葡萄糖摄取和乳酸生成增多，提示Warburg效应增强可能是肿瘤细胞对抗替莫唑胺的保护性机制之一。而双香豆素可明显降低降低替莫唑胺引起的葡萄糖摄取和乳酸生成增多的效应。

综上，我们的研究结果表明，双香豆素可通过抑制PDK1活性，改变U87MG细胞代谢模式，进而增加U87MG细胞对替莫唑胺的敏感性。本研究再次验证了双香豆素是有效的PDK1活性抑制剂，为其“老药新用”和临床恶性胶质瘤综合治疗提供了新的参考。