新生小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离方法

国敏，郝佳琳，朱庆锋，李丹妮，李小曼

（中国医科大学 1.转化医学研究院，沈阳 110122；2.附属第一医院肿瘤内科，沈阳 110001）

肺泡上皮细胞包括Ⅰ型和Ⅱ型细胞，肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡ epithelial cell，AECⅡ）的数量较肺泡Ⅰ型上皮细胞多，占肺泡上皮细胞的60 %，但其体积较小，仅覆盖肺泡表面的5 %［1-2］。AECⅡ可以合成、储存并分泌肺表面活性物质（pulmonarysurfactant，PS）和相关蛋白，从而降低肺泡表面张力，增加肺的顺应性，维持大小肺泡容积的相对稳定，防止肺不张和肺水肿。近年来，有关AECⅡ的研究［3-4］在国内外已受到高度重视，其与许多肺部疾病的发生发展息息相关，PS的变异是引起新生儿急性呼吸窘迫综合征的重要因素［5-6］。然而，目前缺乏理想的细胞模型，研究出简单、高效、高纯度的方法尤为重要。本研究首次以新生24 h内的小鼠为研究对象，提出一种分离培养原代AECⅡ的新方法，为今后有关肺部疾病的研究提供了较好的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料

DPBS（不含 Ca2+和Mg2+）、Dispase、胎牛血清（美国Gibco公司）；DNA酶 Ⅰ、Mouse IgG（美国Sigma公司）；DMEM培养基（中国BI公司）；免疫磁珠、Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔抗体（美国Invitrogen公司）；表面活性蛋白-A（surfactant protein A，SP-A抗体）、表面活性蛋白-B（surfactant protein B，SP-B）抗体、表面活性蛋白-C前体（prosurfactant protein C，proSP-C）抗体（美国Millipore公司）；生物素化的CD45、CD16/CD32和 Ter119抗体（美国BD公司）；纤连蛋白（中国Corning公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo scientific公司）；正置荧光显微镜（日本Nikon公司）；透射电镜（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 单细胞悬浮液的制备：将一对 C57B/L6雌雄小鼠合笼21 d左右，取出生24 h内的新生小鼠。75%乙醇擦拭新生小鼠腹部皮肤，尖头镊子破开幼鼠腹部，弃掉腹腔脏器，夹断肾动脉，暴露出心脏与肺部。将无菌胰岛素注射器插入心脏右心室，注入1～2 mL DPBS，直到视觉上肺部变白。剥离幼鼠颈部组织，暴露气管。将含有消化酶Dispase的无菌胰岛素注射器插入气管，针头不要插入过深，避免插进支气管。缓慢均匀注入100～150 μL Dispase，直至整个肺部由白色变为充盈、半透明状态。若只有一侧肺充盈而另一侧肺未变，则说明进针过深，进入支气管。肺部塌陷5 min后剥离出肺组织，尽量去除气管、支气管和血管组织，并将肺组织移至含有1 mL Dispase的EP管中。在室温摇床上孵育20 min后，将肺组织剪碎，使其充分与Dispase接触，并在摇床上继续孵育20 min。放置于4 ℃离心机，以300g离心10 min后，弃上清，留下肺组织和细胞。在EP管中加入2 mL含有DNA酶Ⅰ的DMEM培养基（0.01 % DNA酶Ⅰ+1 %Pen/Strep+10 %胎牛血清），混匀并放置于室温摇床上孵育10 min。将得到的细胞悬浮液依次通过100目、400目和425目细胞过滤筛网，每次用500 μL上述DMEM培养基冲洗各过滤器。通过血细胞计数器进行细胞计数。放置于4 ℃离心机，以300g离心10 min后，弃上清，每107细胞重悬于0.4 mL DMEM完全培养基（1 % Pen/Strep+10 %胎牛血清）中，数量不足的计为107。分别加入5 μL生物素化的CD45、CD16/CD32和 Ter119抗体。充分混合后，4 ℃下孵育10 min。如果肉眼可见细胞沉淀偏红，即血细胞多，可适当增加Ter119抗体剂量。此时应同时清洗免疫磁珠。取新EP管，每1×107细胞加入10 μL 免疫磁珠，用500 μL DPBS冲洗，置于磁力架上5 min，弃液。重复3次。在孵育完毕的EP管中加入500 μL DMEM完全培养基洗涤细胞，放置于4 ℃离心机，300g离心10 min。每1×107个细胞用90 μL DMEM完全培养基重悬细胞沉淀。再加入洗好的免疫磁珠，充分混合并在4 ℃下孵育15 min。加入500 μL DMEM完全培养基液洗涤细胞，放置于4 ℃离心机，以300g离心10 min。此时，与免疫磁珠结合和未结合的细胞均在沉淀中。弃上清，将细胞沉淀重悬于500 μL DMEM完全培养基中。

1.2.2 磁珠分离：将上述EP管置于磁场中，静置10 min后磁珠均被吸附到管壁上，收集上清（含有未与免疫磁珠结合的细胞到新的EP管中，此为初步纯化的AECⅡ）。每次用500 μL DMEM完全培养基清洗免疫磁珠，共3次。3次收集的上清置于同一管中。通过血细胞计数器进行细胞计数。AECⅡ培养：放置于4 ℃离心机，以300g离心10 min后，用DMEM完全培养基悬浮并铺在IgG抗体包被的细胞培养皿中。在37 ℃、5 %CO2培养箱中培养12 h，收集未附着的细胞悬浮液。放置于4 ℃离心机，以300g离心10 min。细胞计数，将细胞铺在加有纤连蛋白的60 mm培养皿中继续培养。

1.3 台盼蓝染色判断细胞活力

取接种到培养皿的细胞悬液和0.4 %的台盼蓝溶液各50 μL，充分混匀，静置1～2 min。取10 μL细胞悬液进行细胞计数。低倍镜计数500细胞，其中细胞被染成蓝色为死亡细胞，无色为活细胞。细胞存活率（%）=（总细胞数-着色细胞数）/总细胞数×100 %。

1.4 AECⅡ的鉴定

1.4.1 电镜鉴定：取培养24 h后的细胞，用胰蛋白酶消化并用完全培养基终止消化后，放置于4 ℃离心机，1 500 r/min 离心10 min，弃上清，并沿着管壁缓慢加入2.5 %戊二醛，固定24 h后按照电镜切片制作步骤进行制备，并在电镜下观察细胞。

1.4.2 免疫荧光技术检测特异性肺泡表面活性蛋白的表达：将1×105细胞接种于24孔培养板中（预先放置玻璃片），继续培养48 h后弃掉培养基，将细胞固定于4 %多聚甲醛中30 min，PBS洗涤3次后，用含有0.5 % TritonX-100的PBS室温打孔15 min。PBS 洗涤3 次，在即用型山羊血清中加入0.5% TritonX-100作为封闭液，室温封闭细胞1 h。加入proSP-C/SP-B的特异性一抗，4 ℃摇床孵育过夜。室温下PBS洗涤3次，滴加用封闭液稀释的1∶200的荧光二抗，避光并室温孵育1 h，PBS 洗涤3次，细胞核DAPI染色5 min，PBS 洗涤3 次，荧光封片剂封片。正置荧光显微镜观察阳性细胞染色情况。

1.4.3 蛋白免疫印迹技术检测细胞中特异性蛋白的表达：刮取培养24 h的细胞干，加入细胞裂解液裂解细胞后，放置于4 ℃离心机，13 500 r/min离心20 min获得蛋白液，定蛋白总量为30 μg、总体积为20 μL，制成蛋白样品。将蛋白样品加入上样孔中进行凝胶电泳，直至分离胶中看到不同分子量的蛋白明显分开。在4 ℃冰箱中，80 V恒压下可将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，大约2 h。用TBST配置5 %的脱脂奶粉作为封闭液，室温封闭1 h，将proSP-C和SP-A的特异性一抗分别按照抗体说明书用TBS稀释，放置4 ℃摇床上孵育过夜。次日，用TBST洗3次，每次10 min，室温孵育二抗1 h，用TBST洗3次，每次10 min，再应用底物化学发光法进行检测。

2 结果

2.1 细胞计数及活力检测

经过磁珠分选后，初步纯化的AECⅡ细胞量为4×106，铺在包被IgG的培养皿24 h后，纯化的AECⅡ为2×105。

2.2 透射电镜结果

透射电镜结果显示，AECⅡ表面可见微绒毛，细胞器丰富，尤其多见细胞特异结构板层小体，多数呈同心圆排列，见图1。

图1 透射电子显微镜中AECⅡ的形态 ×12 000Fig.1 The form of AECⅡ in transmission electron microscopy ×12 000

2.3 免疫荧光结果

免疫荧光结果显示，肺泡表面活性蛋白在AECⅡ表达呈阳性。proSP-C和SP-B用绿色荧光标记，细胞核DAPI染色呈蓝色，见图2。

2.4 免疫印迹结果

以肺泡上皮细胞MLE12作为阳性对照组，根据条带的位置，可以观察到分离纯化后AECⅡ表达的proSP-C、SP-A蛋白呈阳性，见图3。

图2 肺泡Ⅱ型上皮细胞中SP-B和proSP-C的表达 ×400Fig.2 The expression of SP-B and proSP-C in AEC Ⅱ ×400

图3 AECⅡ中免疫印迹检测SP-A和proSP-C的表达Fig.3 The expression of SP-A and proSP-C in AEC Ⅱ detected by Western blotting

3 讨论

原代AECⅡ的分离纯化方法有很多，例如差速贴壁法、梯度离心法和酶处理法等［7-8］，但大多数存在处理时间较长，操作繁琐，纯度不高等不足。将酶处理法和免疫磁珠分选法2种方法结合到一起，大大缩短了小鼠肺细胞体外处理的时间，并且能得到高纯度的AECⅡ。首先灌注肺组织，冲出留在肺泡血管中的绝大部分血细胞，然后通过气管直接在肺中注入Dispase，使消化酶充盈在肺泡细胞之间，高效消化细胞。利用AECⅡ较小的特点，使单个肺细胞依次通过不同孔径的细胞过滤筛网，AECⅡ能通过小孔径的筛网。接着，应用免疫磁珠分选法，在磁场下将表达CD45（白细胞）、CD16/CD32（巨噬细胞）和Ter119（红系细胞）的细胞吸附去除，上清液中的细胞即为初步纯化的AECⅡ。由于IgG可与含IgG Fc受体的淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞牢固结合，所以用IgG抗体包被的培养皿，能进一步清除杂细胞并纯化AECⅡ［8］。最后在细胞中加入纤连蛋白，使AECⅡ黏附在培养皿上，以便于继续培养。

通过电镜可以清楚观察AECⅡ的形态及其内容物。AECⅡ表面有微绒毛，在胞质中含有丰富的细胞器，其中特异结构板层小体是鉴定AECⅡ的一个重要指标。除此之外，还可以检测AECⅡ分泌的脂蛋白PS［9-11］。联合这两种方法，再用小鼠肺上皮细胞设置阳性对照，从而对比判断AECⅡ。

AECⅡ是多能干细胞，可以分化成肺泡Ⅰ型上皮细胞［8，12］，但在体外不容易增殖。因此对于AECⅡ的培养时间以及如何减缓其分化有待进一步研究。每种分离方法都避免不了细胞破坏，如何最大程度减少细胞的损伤，是接下来要改进的方向。