反应氧族促进血管生成的作用及其脑内意义

郑贝贝 冯 硕 郭梦圆 冯 璞 岑 娟 张 峰

河南大学药学院天然药物与免疫工程重点实验室，开封，475004，中国

脑卒中具有高发病率和致残率，与心血管疾病及恶性肿瘤并称为人类三大死亡疾病。缺血性脑卒中的发病率为91.3～263.1 人/10 万人，年平均发病率为145.5 人/10 万人。缺血性脑卒中占卒中患者的70%～80%。缺血性脑卒中的主要原因是缺血性脑血管疾病引起脑内的血氧供应障碍，导致全脑缺血或局灶性缺血缺氧，使大脑功能迅速衰竭［1］。其损伤机制主要涉及氧化应激、炎症反应、兴奋性氨基酸过表达、Ca2+离子超载等。其中，反应氧族（reactive oxygen specise，ROS）是脑缺血发展过程中的核心因素［2］。在缺血急性期，ROS 大量生成，氧化系统与抗氧化系统平衡被破坏，ROS 大量产生破坏细胞内蛋白质，脂质及DNA 等大分子物质，引起细胞缺血性死亡造成脑损伤。然而，低浓度的ROS 在组织修复和血管生成过程中发挥重要作用［3］。脑缺血后抗氧化治疗，一定程度上影响了缺血后血管生成及组织修复，因此适当调控ROS 含量，促进血管生成是治疗缺血性脑血管疾病的关键。

1 反应氧族与脑缺血

1.1 脑缺血的抗氧化治疗

目前，早期的溶栓治疗和抗氧化治疗是治疗缺血性脑卒中的主要手段。然而，溶栓治疗的治疗窗短，仅为发病后的3 h 内，此外还可能导致颅内出血，这些都阻碍了溶栓治疗的应用［4］。抗氧化治疗主要使用抗氧化剂或者自由基清除剂，降低氧化应激造成的损伤。抗氧化剂药物主要通过抑制ROS 的产生，加速ROS的消除，促进ROS 的降解来降低ROS 的含量，降低氧化应激损伤，发挥神经保护作用。然而缺血后的抗氧化治疗也存在诸多问题：首先目前的研究无全面了解ROS 在缺血脑卒中不同时期不同的生理作用，不同剂量所发挥的不同作用；其次缺少氧化应激标记物，脑组织中ROS 含量低且半衰期短，无法精确检测，从而不能有效调控抗氧化剂的剂量；最后不能准确检测ROS含量变化，其下游信号通路及功能蛋白的变化［5］。近年来研究表明，ROS 在缺血性脑卒中后发挥着重要的病理生理作用，ROS 不仅介导缺血后脑组织损伤，还参与调控缺血后组织修复。因此，了解ROS 在脑缺血后的特殊生理作用、量效关系和作用机制意义重大。

1.2 ROS 的来源及生理环境

ROS 是细胞有氧代谢过程中产生的含氧产物，主要来源于线粒体呼吸链。ROS 包括具有单电子的自由基及非自由基小分子氧化合物，主要亚型为：超氧阴离子（）、羟基自由基（OH•）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）和臭氧（O3）。在正常生理条件下线粒体复合物I 和III 产生ROS，而在缺氧时，线粒体复合物Ⅱ也会生成ROS。此外，一些氧化还原酶例如黄嘌呤、乙酰-CoA、NAD（P）H 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）是其产生的其他来源。

机体内具有防御性的抗氧化系统，抗氧化系统由抗氧化物酶和一系列非酶抗氧化物小分子组成［6］。抗氧化物酶主要由超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等 组成；非酶抗氧化物主要是维生素C、维生素E 和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等。除此之外，解耦联蛋白（uncoupling protein，UCP）也可通过其解偶联作用，降低线粒体膜电位，抑制ROS 的生成［7］。正常生理情况下，因为抗氧化系统的存在，ROS 含量保持较低水平，抗氧化物通过还原反应使ROS 主要为H2O2的形式。H2O2因其性质较稳定、半衰期较长，是机体内ROS 发挥信号作用的主要分子。病理状态下，机体内氧化系统平衡被破坏，ROS 大量生成、机体内抗氧化系统无法清除大量产生的ROS，造成体内ROS 堆积致使细胞损伤，称为氧化应激。

1.3 ROS 生理作用的特殊量效关系

ROS 对细胞生理功能具有双向效应，高水平ROS具有细胞毒性，可诱导细胞凋亡甚至坏死［8］。然而短期或低浓度的ROS 可激活生长及再生的信号通路、促进抗氧化应答、发挥机体保护作用［9］。近年来相应的热点研究将此称为自我保护、或异质保护、预适应、适应性应答、代偿机理，毒物兴奋效应、外源兴奋效应等，其特点为剂量-效应曲线在低浓度下多呈双相、或U 型、倒U 型等。研究表明ROS 与血管生成的关系也具有相应趋势：高浓度的H2O2可损伤内皮细胞，而低浓度H2O2的可刺激血管管腔结构的形成。Yasuda等［10］用H2O2作用于牛胸主动脉内皮细胞，结果表明：H2O2＞125 μmol·L-1时可引起内皮细胞损伤，而低浓度H2O2（0.1～10 μmol·L-1）则有促进内皮细胞官腔结构形成的作用。Bir 等［11］用Gclm 突变体小鼠左侧股骨动脉结扎模拟外周动脉疾病，研究结果表明低水平过氧化物（9.82～11.38 Pm·mg-1组织）可诱导血管生成。本课题组进一步研究表明：100 μmol·L-1以上双氧水长期孵育可导致大鼠脑微血管内皮细胞凋亡甚至坏死，浓度在25～100 μmol·L-1之间会抑制大鼠脑微血管内皮细胞生长，0.1～12.5 μmol·L-1则可促进大鼠脑微血管内皮细胞新生，该量效关系与上述文献所述相符。

2 脑缺血后的血管新生途径

缺血后的血管生成可改善血氧供应，降低缺血区组织损伤，为神经发生与突触重塑创造条件，对脑缺血后的组织修复具有重要意义。脑缺血后的血管生成是一个复杂的过程，由内皮细胞，周细胞和平滑肌细胞共同完成。在众多促血管生成因子的作用下，内皮细胞从原有的血管上出芽，并增殖、迁移、分化、黏附形成新的血管。脑缺血后，在低氧及炎症状态下，血管内皮生长因子（vascular endothelial erowth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）这类促血管生成因子上调，与血管内皮细胞膜上的特异性受体结合，激活下游信号通路，促进血管生成［12］。

2.1 血管内皮生长因子与血管生成

VEGF 是最主要促血管生成细胞因子，可直接作用于内皮细胞。VEGF 家族中VEGF-A 和VEGF-C 是血管生成的关键调节因子。VEGF 受体属于酪氨酸激酶受体家族，其中VEGFR-1 与VEGFR-2 多在内皮细胞表达，可与VEGF 结合影响内皮细胞的各种活动，对缺血后的血管生成具有重要作用［13］。生理状态下，VEGF在成熟器官中含量较低，而在一些血管丰富的组织中表达较高。细胞缺氧可提高VEGF 的含量约12 倍［14］。脑缺血后，缺血组织中VEGF 表达升高，在4 d 达到峰值，7～10 d 后下降至正常水平。VEGF 可能促进神经再生、神经保护、胶质细胞生长从而优化血管新生环境。

2.2 Notch 信号通路与血管生成

Notch 信号通路是动物中高度保守的信号通路，该通路在细胞增殖与分化、突触重塑及细胞凋亡及老化等各过程都发挥重要作用。在哺乳动物中，Notch 同源配体Dll4 主要在新生血管末端顶端细胞中表达，参与调控VEGF 启动的血管生成。脑缺血后，缺血缺氧会激活Notch 信号通路，主要通过调控血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖与分化，来调控血管生成［15］。

2.3 血管生成素与血管生成

血管生成素（angiopoietin，Ang）是分泌型血管生成相关因子，是血管生长必需的。

Ang 家族1～4，均是Tie2 受体的配体，在血管生成的后期促进血管的稳定和扩大。脑缺血后Ang 系统与VEGF 系统协同作用，共同调节缺血后的血管新生。

2.4 缺氧诱导因子-1 与血管生成

缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是缺血缺氧时基因表达的关键调节者。大多数情况下，HIF-1 活性由HIF-1α 亚基决定。氧含量正常的情况下，HIF-1α在胞浆中被羟基化很快降解。缺血缺氧情况下，羟化酶活性降低，HIF-1 复合物累积并转移入核，引起HIF-1 靶基因的转录表达，提高机体对缺氧的耐受。低剂量的H2O2模拟轻度缺血缺氧预处理，激活HIF-1 表达有助于神经保护［16］。HIF-1 可调节促存活和增殖相关的基因，例如VEGF，促红细胞生成素 （erythropoietin，EPO），葡萄糖转运蛋白1 （glucose transporter 1，GLUT1）。缺氧状态下，HIF-1 表达上调，上调VEGF 和VEGFR 的表达，激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和ERK1/2 信号通路，促进内皮细胞增殖、迁移，促进血管新生［17］。

2.5 核转录因子-κB 与血管生成

核转录因子-κB（nuclear factor -κB，NF-κB）是调控DNA 转录，细胞因子合成及可细胞增殖的关键细胞核转录因子。NF-κB 在炎症相关的疾病中扮演重要角色。相关研究表明：阻断NF-κB 信号通路的激活，血管平滑肌细胞的增殖和迁移被抑制，受损血管新生内膜减少，血管生成减少［18］。Susan F.Fitzpatrick 等［19］人的实验表明：缺氧时HIF-1α和NF-κB 表达升高，且当缺氧依赖的HIF-1 存在时，NF-κB 通路就激活。缺氧状态下NF-κB 还可通过调控HIF-1α 及转录因子AP-1，诱导VEGF 的表达，促进血管生成［20］。

3 ROS 促进血管生成的分子机制

近年来相关研究表明，ROS 是体内血管生成稳态的重要调控者。根据上述ROS 的特殊量效关系可知，ROS 对血管相关细胞的作用取决于活性氧的含量。高水平的ROS 引起氧化应激，导致参与血管生成的细胞死亡，不仅抑制血管生成，还损伤血管内皮细胞。然而，低水平的H2O2可调节内皮细胞的增殖。体内研究也表明机体缺血后，组织局部缺氧，ROS 作为信号传导分子，参与细胞内增殖、转录、凋亡信号的传递，还可通过影响Ca2+流动，蛋白质磷酸化及转录因子的活性，发挥促血管新生作用。一定水平的ROS 可作为信号分子启动转录因子HIF-1α的表达，也可增加VEGF 的稳定及表达。ROS 可增加促血管生成相关因子的表达，例如VEGF 和它的受体VEGFR-1，VEGFR-2。

3.1 血管内皮细胞中ROS 的来源及作用

内皮细胞中的ROS 主要来源于NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）和线粒体呼吸传递链。NOX家族包括NOX 1～5，其下游均涉及HIF-1 的调控。NOX 1、2、4 和5 在内皮细胞中表达，维持基本的ROS 的产生，其主要形式为H2O2和。由NOX2 和NOX4 产生的ROS 能够增加内皮细胞的增殖及生存能力，可能与ROS 激活酪氨酸激酶受体及磷酸化P38、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信号通路有关。NOX4 在内皮细胞的表达占主要优势，主要的形成的ROS 以H2O2为主。在血管内皮细胞中，NOX4 过表达时，ROS 可刺激VEGFR-2 自身磷酸化和Akt 的激活，促进内皮细胞的迁移和增殖。NOX2 基因沉默可诱导凋亡的关键酶半胱天冬酶3 和半胱天冬酶7 的激活；然而在血清剥夺刺激的情况下，NOX4 过表达能够抑制凋亡酶的激活。这些都表明来源于各种NOX 亚型的ROS 能够发挥血管内皮细胞的保护效应。

ROS 可调控血管内皮细胞的增殖、迁移和基质的重塑。在内皮细胞受到应力刺激时，ROS 作为信号分子参与细胞内自噬的调节和促进内皮细胞的生存。抑制线粒体生成ROS 能够减少由趋化素或者2-脱氧-D-葡萄糖诱导内皮细胞自噬过程中腺苷酸活化蛋白激酶的激活。Yang 等［21］用大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型研究ROS 在脑缺血中的作用，结果表明ROS 在缺血早期大量生成，损伤脑组织功能，在缺血后期参与了脑组织的修复及再生。ROS 含量在再灌注后1 h 达到顶峰，随后逐渐下降，在再灌注3 d 时降到最低点与假手术组含量相当，随后逐渐上升在灌注后第7 d 达第二个峰值，然后保持平稳趋势到28 d。在再灌注的28 d 内ROS 含量变化的趋势图与VEGF 趋势类似，提示ROS 可能通过影响VEGF 的表达，调节血管生成，参与脑缺血后的组织修复。人脐静脉内皮细胞的研究表明，瘦素可通过增加ROS 的积累，促进血管新生［22］。小鼠肺缺血血管生成模型表明：ROS 对缺血诱导的血管生成有重要作用。敲除NOX2 基因的后肢缺血老鼠其血管生成能力以及内皮细胞的增殖和迁移能力都显著减弱［23］。

3.2 ROS 可激活PI3K/Akt 信号通路促进血管生成

Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该激酶在调控细胞增殖与迁移中发挥重要作用，与细胞存活关系密切。经典信号通路PI3K/Akt 可参与调控细胞的增殖与存活，细胞的生长及凋亡。本课题研究表明长期孵育低浓度的H2O2，可提高细胞增殖率，上调MCF-7 细胞上P-gp，Nrf2，HIF-1α 的表达，该作用 与PI3K/Akt 信号通路的激活有关［24］。相关研究亦表明H2O2提高了内皮细胞中PI3K 的表达，可促进内皮细胞增殖和迁移，促进血管生成［25］。

3.3 ROS 可调控缺氧诱导因子HIF-1α促进血管生成

HIF-1α 作为缺氧调节的关键因子，在多种缺血性疾病中扮演重要角色。HIF-1α靶基因众多，可促进血管生成，调节能量代谢，促红细胞生成，提高机体对缺氧的耐受，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖修复受损细胞。ROS 对HIF-1 的稳定起重要作用。低剂量的H2O2模拟缺血缺氧预处理，激活HIF 并影响HIF-1 靶基因VEGF，EPO 及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表达，促进神经细胞适应低氧下生存条件［26］。细胞缺氧时，线粒体产生ROS 增多，诱发缺氧诱导因子HIF-1 的释放，进而促进VEGF 基因的转录，VEGF 及VEGFR2 的表达都上调。VEGF 激活内皮细胞中酪氨酸激酶受体（主要是VEGFR-1，VEGFR-2）［27］。VEGFR-2通过自身磷酸化的激活，影响内皮细胞的增殖和迁移。

3.4 ROS 可激活Nrf2 信号通路促进血管生成

NF-E2 相关因子2（NF-E 2-related factor 2，Nrf2）是氧化应激反应相关的重要转录因子，可调控其下游的多种抗氧基因及Ⅱ相解毒酶基因的表达。生理状态下，Nrf2 作为转录因子，与Keap1 结合以无活性状态存在于胞质中。机体在氧化应激时，Keap1 构象改变，导致Nrf2 与Keap1 解偶联释放出来，游离的Nrf2 入核与抗氧化物反应元件（antioxidant reactive element，ARE）结合，激活下游靶基因，发挥抗氧化作用。脑缺血后产生的ROS 能够激活 Nrf2 信号通路，Nrf2 随后激活ARE 基因发挥抗氧化，抗炎，抗凋亡作用［28］。激活的Nrf2 调控HIF-1α，可上调VEGF/VEGFR-2 信号通路，发挥促血管生成作用［29］。

3.5 ROS 对VEGF 的直接作用

近年来研究表明：缺血缺氧或低氧刺激时产生的低浓度ROS 作为信号分子，诱导细胞内VEGF 表达升高，升高的VEGF 与VEGFR2 结合，反式激活NADPH氧化酶，产生更多的ROS 参与氧化还原反应，促使细胞膜上VEGFR2 磷酸化，调控血管内皮细胞增殖和迁移，进而调控血管生成。在内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞中外源性的ROS 可影响VEGF 的表达，VEGF 通过内源性ROS 的产生诱导内皮细胞增殖与迁移。

外源性H2O2作用于人脐静脉内皮细胞时，通过p66Shc 磷酸化作用Src 提高线粒体ROS［30］。内皮细胞线粒体ROS 信号可反式激活VEGFR2 和VEGF 诱导细胞迁移有关。H2O2诱导血管平滑肌细胞及内皮细胞中VEGF 的表达，使用鱼藤酮和寡霉素均能抑制线粒体呼吸作用，减弱H2O2诱导牛主动脉内皮细胞VEGFR2酪氨酸的磷酸化［31］。自由基清除剂的使用可抑制血管生成，也进一步证实了ROS 的促血管生成的功能。

4 总结与展望

在脑缺血发生后，高水平的ROS 介导了缺血后的组织损伤，而低水平的ROS 在组织修复与再生过程中发挥积极作用。其他神经退行性疾病同样存在相似的病理生理机制［32］。ROS 的积极作用不仅表现为促进血管生成，还包括激活机体自身的抗氧化体系、激活细胞保护机制、促进受损细胞内营养物质的循环再利用等［33］。基于此，以消除ROS 为目的的主流抗氧化治疗模式有待改进，而药物递送系统或将为相关研究提供大量发展机遇［34］。综上，全面了解ROS 的多重生理功能，进一步掌握ROS 在脑缺血后的动态过程及介导其特殊优势的作用机制，不仅可以优化抗氧化损伤的药物作用，还可通过促进血管生成，多靶点改善预后结果。