脂肪干细胞局部注射改善淋巴水肿的实验研究

周晨笑 苏万春 李 娜 梁顺涛 张国英 马 刚 李沛霖 崔 磊,*

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院整形外科,北京 100089；2.首都医科大学附属北京世纪坛医院淋巴外科,北京 100089；3.首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室，北京 100089)

淋巴水肿是由于淋巴系统发育不良或继发性损害引起淋巴液回流障碍，导致身体局部淋巴液滞留，进而继发脂肪增生、组织纤维化等一系列的病理生理改变[1]。淋巴水肿的慢性疾病进程严重影响患者的生活和工作，深入了解淋巴水肿的发病机制、探索更有效的治疗方法意义深远。

炎性反应在淋巴水肿病理生理学中起着不可或缺的作用。研究[2-5]证实，淋巴水肿增生的脂肪组织中有各种炎性反应细胞浸润，例如CD4+T淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、Treg等。其中，CD4+T细胞在局部病灶的持续积累抑制淋巴管生成，并促进收集淋巴管的硬化，导致水肿和组织纤维化[6]。此外，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)[7]、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)[8]等多种炎性反应因子参与了淋巴水肿的疾病发生、进展。

最近，脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)在免疫相关疾病的研究中获得很多关注。ADSCs是脂肪组织来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，具有来源广、成本低等优势[9-12]。ADSCs在体外实验及多种疾病模型中表现出免疫抑制作用[13]。研究[14]显示，淋巴水肿组织中ADSCs含量减少，ADSCs是否作为有利因素在淋巴水肿组织微环境中耗竭还未可知。本研究主要讨论淋巴水肿组织中局部补充ADSCs后，是否可以缓解淋巴水肿。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

本试验所用实验动物为C57BL/6J小鼠，雌性，6～8周龄(中国维通利华公司)，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2017-0025，本实验通过首都医科大学附属北京世纪坛医院科学研究伦理委员会审批(2019年科研伦审第18号)，所有操作按照规范实施。本次实验普通C57小鼠共50只，其中ADSCs组20只，PBS对照组30只。

1.2 ADSCs的提取、体外培养传代、诱导

取C57乳鼠腹股沟及颈项部皮下脂肪，参照文献[15-16]的方法提取ADSCs。首先将脂肪剪碎；加1 g/L的Ⅰ型胶原酶(美国Worthington公司)，置于摇床中，37 ℃，150 r/min，消化60 min；2 000 r/min 离心10 min；沉淀用配好的培养基重悬，接种于细胞培养皿，37 ℃，5%(体积分数)CO2细胞培养箱中培养。培养基为低糖DMEM(美国HyClone公司)，加入10%(体积分数)胎牛血清(foetal bovine serum，FBS，中国中生奥邦生物科技有限公司)，1%(体积分数)青霉素-链霉素混合溶液。细胞每48～72 h换液；贴壁细胞密度约90%时传代，第3代至第5代(P3～P5)用于本研究的所有体内外实验。

细胞密度>90% 时进行成脂诱导，成脂诱导液：低糖DMEM加入10%(体积分数)FBS、1%(体积分数)青霉素-链霉素混合溶液、200 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L 胰岛素、1 μmol/L地塞米松。诱导第14天行油红染色。

细胞密度约60% 时进行成骨诱导，成骨诱导液：低糖DMEM加入10%(体积分数)FBS、1%(体积分数)青霉素-链霉素混合溶液、0.1 μmol/L维生素D3、50 mmol/L维生素C磷酸酯、10 mmol/L β-甘油磷酸盐。诱导第21天行茜素红染色。

1.3 鼠尾淋巴水肿模型手术

应用10%(体积分数)水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠。显微镜下距离鼠尾根部2.0～2.2 cm位置处做0.2 cm宽的全层皮肤环切，以离断皮肤中的浅部毛细淋巴管。鼠尾两侧的两条侧静脉各有两条深部淋巴管伴行，结扎后离断。透明贴膜环形包扎手术切口，保持切口部位湿润。24 h 后拆除敷料，75%(体积分数)乙醇消毒手术切口附近皮肤。手术前或术后即刻用排水法测量手术切口处至尾尖的体积，之后每周测量1次。

1.4 细胞注射

P3～P5代ADSCs消化处理为悬浮细胞，5×105个细胞溶于15 μL PBS中；造模术后，即刻将15 μL ADSCs悬液或磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)对照，用胰岛素注射器(针头规格：30G)距手术切口部位远端1.5 cm处与鼠尾方向平行进针，针尖到达距手术切口部位远端0.5 cm处注射，注射点在背静脉与侧静脉之间的间隙部位小心进针，防止刺入血管。

1.5 鼠尾组织取材、染色

小鼠麻醉后，刮除鼠尾毛发(便于后期与包埋剂融合)，距离手术切口0.5～0.8 cm的部分小心取材，置于4%(质量分数)多聚甲醛中固定24～48 h。鼠尾固定后切成0.2～0.3 cm厚的小段，需要包埋切片的组织置于10%(质量分数) EDTA中脱钙，37 ℃，7～10 d，脱水、包埋、切片。之后行HE染色(苏木精和伊红染色)、Masson染色(马松染色)。

鼠尾固定后切成0.2～0.3 cm厚的小段；PBS洗涤3遍，每次3～5 min；置于BODIPY (美国Molecular Probes公司)+Hochest 33258 (中国碧云天公司)工作液中浸染，室温下15～20 min；PBS洗涤3遍，每次3～5 min；共聚焦荧光显微镜(日本尼康公司A1)下观察、拍摄。

切片于1× 柠檬酸盐(0.01 mol/L)中抗原修复，山羊血清封闭，一抗4 ℃ 孵育过夜；室温复温1 h；滴加与一抗对应的二抗，室温孵育1 h；PBS缓冲液洗后用含DAPI的封片剂封片；阅片，4 ℃避光保存。应用正置荧光显微镜(日本尼康公司ECLIPSE TS200)阅片、拍摄。

本试验所用到的一抗：淋巴管内皮透明质酸受体1抗体 (anti-lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-1)(1∶500,英国Abcam公司),二抗：山羊抗兔Alexa Fluor 488荧光二抗 (英国Abcam公司)。

淋巴回流检测(FITC-Dextran标记鼠尾淋巴回流):FITC-Dextran (2 000 000,25 g/L,美国Sigma公司)溶于PBS中配制成25 g/L的工作液，锡箔纸包裹避光，现用现配；腹腔注射10%(体积分数)水合氯醛(4 mL/kg)，麻醉小鼠，在距离尾尖1.5 cm位置处皮下注射15 μL FITC-Dextran工作液；15 min后于宏观荧光显微镜下拍照，保证工作环境黑暗，曝光时间调至70 ms。

1.6 统计学方法

本研究中数据应用GraphPad Prism 6.02进行统计分析以及作图，两组数据的比较采用Studentst检验，多组实验组与对照组分别进行比较时采用Dunnett检验法，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADSCs局部注射后鼠尾肿胀缓解

ADSCs贴壁生长，成梭形,成脂诱导后，油红染色见细胞内红染的油滴形成；成骨诱导后，茜素红染色见红染的钙结节沉积(图1)。两种染色说明了ADSCs正常的两系分化能力。对提取的ADSCs进行初步鉴定后，在手术当日将ADSCs注射于鼠尾皮下。注射ADSCs后1～4周，鼠尾体积较对照组减小，4周之后与对照组比较，差异无统计学意义。HE染色可见皮下组织的厚度减小，组织Whole mount-BODIPY荧光染色可明确脂肪厚度亦明显减轻，平均值降低约40%，效果明显(图2)。

图1 C57小鼠脂肪干细胞体外培养及诱导Fig.1 In vitro culture and induction of ADSCs extracted from C57 subcutaneous adiposeA:ADSCs were cultured in vitro and that at passages 3 to 5 were used in the following studies,Bar=200 μm;B：Oil red O staining of ADSCs were performed after adipogenic differentiation for 14 days,Bar=50 μm;C：Alizarin red staining of ADSCs were performed after osteogenic induction on days 21,Bar=200 μm;ADSCs:adipose derived stem cells.

图2 ADSCs局部注射后鼠尾体积减小，皮下组织及脂肪厚度减少 Fig.2 Change in edema and subcutaneous fat thickening in mouse tail lymphedema modelsA:representative photographs of tails;B：quantification of tail volume changes (n=11-30),*P<0.05;***P<0.001;C：representative HE staining of tail cross-sections with arrows indicating subcutaneous tissues 3 weeks after PBS or ADSCs injection,Bar=1 μm;D：quantification of subcutaneous tissue thickness,***P<0.001;E:Whole-mount staining of BODIPY to indicate subcutaneous adipose tissues 3 weeks after ADSCs injection,Bar=500 μm;F:quantification of subcutaneous adipose tissues,**P<0.01,***P<0.001.ADSCs:adipose derived stem cells.

2.2 ADSCs有效减轻鼠尾皮下组织纤维化

ADSCs干预组的皮下组织的纤维化较对照组有所缓解，Masson染色可见皮下组织中蓝染的胶原纤维减少(图3A)，应用Image J软件分析，胶原纤维所占面积比下降约20%(图3B)。

图3 ADSCs局部注射后皮下组织纤维化减轻Fig.3 Subcutaneous injection of ADSCs reduces fibrotic tissue deposition A:Sirius red histological staining to evaluate fibrotic tissue deposition revealed a reduction of fibrosis 3 weeks after ADSCs injection (n=6 per group,6 HPF per mouse);B:percent of fibrotic area,**P<0.01;ADSCs:adipose derived stem cells.

2.3 ADSCs改善鼠尾淋巴管形态及淋巴回流

淋巴回流是评价淋巴水肿的重要功能指标，术后8周 FITC-Dextran标记后应用荧光显微镜检测荧光，ADSCs组可见大分子荧光染料通过手术切口，而PBS对照组仅见少量通过。且ADSCs干预后，手术切口近心端与远心端荧光比值较对照组升高，ADSCs干预后，淋巴回流有所改善。淋巴管的功能决定淋巴回流，免疫组织化学和免疫荧光染色均证实，ADSCs干预后，虽然每个高倍镜下的淋巴管数量未发生变化，但是横截面积减小约3倍，说明淋巴管功能改善(图4)。

图4 ADSCs局部注射后淋巴管形态及淋巴回流改善Fig.4 Subcutaneous injection of ADSCs improves lymphatic vessel functionA:Lymphatic reflux was detected by subcutaneous injection of FITC-dextran and photographed by fluorescence microscopy at 8 weeks postoperatively;B:Lymphatic transport capacity was improved after ADSCs treatment (n=6 per group),*P<0.05;C:Immunofluorescence staining for LYVE-1(green) showed lymphatic vessel 3 weeks after ADSCs transfer,Bar=100 μm;D:Area of lymphatic vessels were decreased in ADSCs transfer group,**P<0.01,***P<0.001;E:number of lymphatic vessels showed no statistical difference (n=6 per group,6 HPF per mouse),*P<0.05.ADSCs:adipose derived stem cells;LYVE-1:lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1;HPF：high power mirror.

3 讨论

目前，ADSCs已被用于多种疾病的研究，干预方式主要分为静脉注射及局部注射。考虑到局部作用方式更直接，且静脉注射有肺静脉栓塞的风险[17]，故本研究选择局部皮下注射。

ADSCs干预后，鼠尾肿胀减轻，充分说明了ADSCs注射对于缓解淋巴水肿的有效性。但是，鼠尾的体积只在ADSCs注射后4周内差异有统计学意义(P<0.05)，之后与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。推测出现这种情况的原因：首先，研究[18]显示，ADSCs在没有特殊载体情况下，以缓冲液为悬液直接局部注射，活体小动物成像检测显示其可在局部存活1周。所以考虑ADSCs注射1周后细胞量逐渐减少，无法维持更有效的作用。其次，鼠尾模型有自限性[4]，随着时间的推移，二者差距逐渐减少。至此，为了得到更明显的治疗效果，考虑可以多次注射ADSCs。Conrad等[19]多次注射MSCs,结果差异有统计学意义。因为鼠尾模型的特殊性，在实施过程中，多次皮下注射明显增加鼠尾出血、坏死、掉尾等情况的发生率，所以实验未能成功进行。

淋巴水肿局部病灶中，皮下脂肪组织增厚是最为显著的病理变化[14,20]。此外，纤维化也是重要的病理变化，研究[14]显示，不仅组织皮下脂肪发生纤维化，淋巴管壁以及新生的毛细淋巴管均出现纤维化，纤维化严重影响淋巴管功能，加重淋巴水肿[20-21]。淋巴水肿中，淋巴回流受阻，导致淋巴液逆流，皮层内毛细淋巴管显著扩张，功能受损。

淋巴水肿动物模型研究[4]显示造模后2周，淋巴水肿病灶中出现大量新生的淋巴管，但是新生的淋巴管管腔不规则，腔内面积增大，Ogata等[22]认为，这种不成熟淋巴管的大量形成不利于淋巴水肿的预后。ADSCs干预后，鼠尾皮下组织及脂肪层厚度减少、纤维化减轻、淋巴管横截面积减小、淋巴回流改善，充分说明了ADSCs注射对于缓解淋巴水肿的有效性。

多项研究[13,23-24]显示，ADSCs具有低免疫原性，它通过抑制淋巴细胞反应、诱导M2型巨噬细胞、增强巨噬细胞的免疫抑制能力、诱导Treg等多种方式抑制免疫反应。炎性反应在淋巴水肿疾病进展中起着不可或缺的作用，因此笔者认为，ADSCs对淋巴水肿的缓解作用，可以通过缓解局部炎性反应而实现。

总之，ADSCs对淋巴水肿具有明确的缓解作用。作用机制也许存在多种，仍有待于进一步探索。同时，ADSCs对于临床治疗淋巴水肿疾病具有潜在的应用前景。