人参皂苷Rh2调控PI3K/Akt促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用

张春玲，王贺玲，卢 艳*

（1.廊坊长征医院心内科，河北 廊坊 065000；2.哈尔滨医科大学附属第四医院 心内科，哈尔滨 150000）

骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）是一种来源于胚胎发育时期的中胚层细胞，具有较强的自我复制和多项分化潜能的成体干细胞[1]。既往研究证实BMSCs 在特定的环境和培养条件下能够分化成为多种功能性细胞，如心肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞以及成骨细胞等[2-3]。近年来，心血管疾病以及肿瘤发病率已经成为危害人类健康重要杀手。有关抗血管性疾病（糖尿病血管病变、冠心病、高血压以及肺病等）药物和抗肿瘤药物已经广泛应用于临床。但是临床药物的使用并不能从根本上改善患者的机体状态。因此，越来越多的研究者将目标投向干细胞治疗，BMSCs 因为具有易于分离和培养、生长迅速以及多项分化和低免疫等特点在治疗心血管疾病以及肿瘤中发挥重要作用[4-5]。通过揭示BMSCs 的增殖和分化机制对疾病相关干细胞治疗具有重要意义。

人参皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2，Rh2）作为人参的主要有效成分之一，具有广泛的抗肿瘤活性以及治疗心血管病变等作用[6-7]。王乐等[8]研究发现Rh2 能够显著增加催产素诱导BMSCs 向心肌细胞转化作用。既往研究发现，Rh2 能够调控PI3K/Akt 信号通路抑制肿瘤细胞的增殖[7]。另外，PI3K/Akt 在对多种类型细胞增殖中发挥重要作用，包括参与了BMSCs 增殖[9]。因此，本研究拟通过分离培养大鼠BMSCs 探究Rh2 能否通过调控PI3K/Akt 信号通路促进BMSCs 增殖作用。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SPF 级SD 大鼠共2 只，周龄3～6周，体质量为180～220 g，购买于凯学生物科技（上海）有限公司（生产许可证号：SCXK（沪）2017-0006），适应性喂养1周，期间饲养环境为12 明暗交替，自由饮水，饮食。细胞组织匀浆仪（H22539，武汉维塞尔生物科技有限公司）；-80 ℃超低温冰箱（DW-86L578J，青岛海尔集团）；4 ℃、-20 ℃冰箱（FYLYS-128，合肥美菱股份有限公司）；高速台式冷冻离心机（SKFH-1600RW，湖南湘仪实验室仪器有限公司）；Western blot 检测装置（125-0098，美国Bio-Rad 伯乐公司）；高纯水机（CSB-20L，美国Millipore 公司）；酶标仪器（HBS-1096A，上海研卉生物科技有限公司）。人参皂苷Rh2（上海顺勃生物工程技术有限公司，纯度＞98%）；LY294002（美国Cell Signaling Technology公司）；L-DMEM 细胞培养基（C11960500BT，gibco公司）；成脂、成骨诱导分化培养基（济南中赛生物）；胎牛血清（10099-141，gibco 公司）；PI3K 抗体（△13158，美国Cell Signaling Technology 公司）、Akt抗体（△24232，美国Cell Signaling Technology公司）、p-Akt 抗体（△12703，美国Cell Signaling Technology公司）、β-actin 抗体（△54943，美国Cell Signaling Technology 公司）；HRP 标记兔二抗（A0227，武汉博士德公司）、HRP 标记鼠二抗（A0286，武汉博士德公司）；一抗稀释液（P0256，江苏碧云天公司）、二抗稀释液（P0023D，江苏碧云天公司）；CCK-8 检测试剂盒（AF0216，江苏碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓间充质干细胞分离与培养 利用颈椎脱臼法处死大鼠，并在无菌条件下分离大鼠四肢长骨尽量去除残多余残留组织。使用磷酸缓冲盐溶液（含有1%青链霉素）混合溶液多次冲洗大鼠长骨两端使其暴露髓腔，随后通过注射器吸取适量的DMEM 培养基反复冲洗骨髓腔，收集得到细胞。最后将收集得到的骨髓腔细胞放置于DMEM 细胞培养基（含10%胎牛血清）中重悬，接种于面积为25 cm2培养瓶中，培养环境在设置温度37 ℃、CO2含量5%的细胞培养箱内培养。培养期间每隔2～3 d 进行细胞换液处理，待细胞融合度达到80%～90%结束原代细胞培养，显微镜下观察细胞形态。[3]

1.2.2 细胞纯化 原代骨髓间充质干细胞培养1～2周且融合度达80%～90%后进行传代培养。传代时用0.25%胰蛋白酶（含 0.02%乙二胺四乙酸）消化2 min，胎牛血清终止消化。终止消化后按照离心机设定，转速：1 000 r/min，离心5 min 收集细胞，最后将重悬后细胞接种于新的细胞培养瓶中。[8]

1.2.3 骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化[7]1）成骨分化：将上述培养的细胞以密度为2×105个细胞接种至6 孔板中（6 孔板预先通过0.1%的明胶处理30 min并清洗），待细胞生长融合度达到60%～70%时，向培养板内加入诱导成骨分化的细胞培养基约2 mL。期间每隔3 d 进行细胞培养液更换。诱导分化21 d 后，通过细胞固定液固定细胞并利用茜素红染色5 min，最后通过显微镜观察着色情况并拍照。2）成脂分化：成脂分化培养包括A 液和B 液两部分处理。首先通过采用成脂分化培养基A 液处理细胞72 h，之后改用成脂分化诱导培养基B，处理细胞24 h，之后再次使用A液体处理细胞72 h。按照上述交替操作3～5 次，最后再次使用B 液继续诱导分化3～7 d。将上述成脂诱导后的细胞用多聚甲醛固定后，油红O 染色约30 min，显微镜下观察染色情况并拍照。

1.2.4 CCK-8 检测人参皂苷Rh2 对骨髓间充质干细胞增殖 将消化后的骨髓间充质干细胞按照96 孔板密度为：1×104/孔接种，细胞贴壁生长24 h 后，实验分为对照组、人参皂苷Rh2 低剂量组、人参皂苷Rh2 中剂量组和人参皂苷Rh2 高剂量组。其中人参皂苷组采用不同浓度（10、20、40 μmol/L）人参皂苷Rh2 处理48 h，每个浓度设置6 个复孔，每孔加入CCK-8 溶液10 μL 继续培养1 h，酶标仪设定波长为450 nm 检测各孔的吸光度值，以OD 值反应细胞的活力。[4]

1.2.5 克隆形成实验检测人参皂苷Rh2 对骨髓间充质干细胞的增殖影响 将分离、纯化得到的第3 代骨髓间充质干细胞中在细胞培养箱中培养分别加入总浓度为10、20、40 μmol/L 的人参皂苷Rh2，持续培养48 h。培养结束后使用PBS 清洗细胞3 次，最后采用多聚甲醛固定细胞，并用0.1%结晶紫细胞染色 10 min，PBS清洗干净后，显微镜下拍照并计数骨髓间充质干细胞细胞克隆数。[9]

1.2.6 CCK-8 法检测LY294002 对人参皂苷Rh2 促进骨髓间充质干细胞增殖影响 将骨髓间充质干细胞种植于6 孔板内贴壁生长24 h 后，待其生长融合度达到70%左右时，加入p-Akt 抑制剂LY294002（20、40 μmol/L）处理4 h后，人参皂苷Rh2高剂量处理细胞48 h，最后通过CCK-8 检测细胞活力。[5]

1.2.7 蛋白质免疫印迹（Western blot） 1）将处理完成的NPCs 放置于1.5 mL 的组织研磨管内并按照1:4比例加入细胞裂解液放置在已经预冷后的细胞组织匀浆仪中进行研磨；2）4 ℃ 12 000×g 离心10 min，收集细胞上清液，采用BCA法进行蛋白质浓度定量检测；3）每孔上样量为30 μg 进行蛋白质凝胶电泳实验，根据目的蛋白分子量大小以及蛋白marker 指示进行切胶，湿转转膜法将蛋白转移至PVDF 膜上，脱脂牛奶封闭2 h，孵育对应一抗（1:1 000）4 ℃过夜，孵育二抗（1:5 000）1～2 h，于摇床摇晃洗膜，含吐温磷酸盐缓冲液（TPBS）洗涤后加入ECL，使用胶片曝光，图片扫描后用 Image J 软件计算各条带的灰度值，以各目标条带灰度值与内参β-actin 条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。[10]

2 结果

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞培养与鉴定 原代大鼠骨髓间充质干细胞多呈现多角形和棱形，培养至第3 代细胞多以棱形为主并呈涡旋样生长（图1）。对培养至第3 代大鼠骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化21 d后，茜素红染色显示大片红色骨结节形成，表明成骨诱导分化成功。成脂诱导分化24 d 后，油红O 染色可见明显红色脂滴形成，表明成脂诱导分化成功（图2）。

图1 原代大鼠骨髓间充质干细胞形态学特征（×200）

图2 大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化（×200）

2.2 人参皂苷Rh2 对骨髓间充质干细胞增殖的影响 CCK-8 法测定Rh2 对BMSCs 增殖的影响。见表1。

表1 Rh2 对BMSCs 细胞活力及克隆数目的影响

2.3 人参皂苷Rh2 对骨髓间充质干细胞PI3K/Akt 蛋白表达的影响 为探究Rh2 对BMSCs 增殖的作用机制。Western blot 检测了PI3K、Akt 和p-Akt 表达水平。与对照组相比，Rh2 中、高剂量组能够显著促进PI3K、p-Akt蛋白表达（P＜0.05 或P＜0.01）；与Rh2 低剂量组相比，Rh2 中、高剂量组PI3K、p-Akt 蛋白表达升高（P＜0.05 或P＜0.01）；Rh2 高剂量组与Rh2 中剂量组无显著性差异（图3，表2）。提示：Rh2 可能通过作用于PI3K/Akt 信号通路促进BMSCs 增殖。

图3 Rh2 对骨髓间充质干细胞PI3K/Ak 蛋白表达影响

表2 相关蛋白表达水平

2.4 抑制PI3K/Akt 对人参皂苷Rh2 促骨髓间充质干细胞增殖的影响 探究人参皂苷Rh2 通过PI3K/Akt 信号通路促进BMSCs 增殖。通过Akt 抑制剂LY294002（20、40 μmol/L）处理细胞后，高剂量Rh2 处理48 h 后。Western blot 检测显示，与Rh2 高剂量组相比，抑制剂LY294002（40 μmol/L）组PI3K、p-Akt 表达显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。CCK-8 检测细胞活力结果显示，与Rh2 高剂量组相比，LY294002 抑制剂（40 μmol/L）组细胞活力显著降低（P＜0.01）（图4，表3）。

图4 LY294002 抑制剂对Akt 蛋白表达影响

表3 LY294002 抑制剂对Rh2 促进BMSCs 增殖的影响

3 讨论

Rh2 是人参的有效活性成分之一，具有广泛的药理学作用，主要包括诱导细胞分化或凋亡，抑制多种肿瘤细胞的增殖以及抗细胞炎症等[10-11]。新近研究发现Rh2 能够促进BMSCs 的分化作用[8]。

既往也证实，BMSCs 可以通过特定条件下增殖，分化为多种功能性细胞进而参与机体特定生物学作用，是一种有前景的治疗性干细胞[12-14]。本研究首先通过对例如淋巴细胞、单核细胞以及BMSCs 等贴壁能力的差异初步纯化大鼠得到BMSCs。为进一步鉴定所培养的细胞为BMSCs，在初步纯化得到的细胞培养至第3 代时，对其进行成骨和成脂诱导分化。结果发现，成骨诱导分化21 d 后，茜素红染色显示大片红色骨结节形成，表明成骨诱导分化成功。成脂诱导分化24 d 后，油红O 染色可见明显红色脂滴形成，表明成脂诱导分化成功。以上结果表明，本研究成功分离得到BMSCs，为后续探究Rh2 对BMSCs 的生物学作用奠定了基础。为探究Rh2 对细胞增殖的影响。本研究首先设置不同浓度梯度的Rh2（2、4、8 μmol/L）处理BMSCs 48 h，结果发现，与对照组相比，Rh2 处理组均能显著增加BMSCs 活力并呈现浓度依赖性特点。同时细胞克隆实验也证实，Rh2 能够显著增加BMSCs克隆细胞数目。那么有关Rh2 对BMSCs 的分子作用机制又是如何呢？PI3K/Akt 信号通路广泛存在于细胞中，参与了包括细胞增殖在内的多种生物学调控过程[15-16]。磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidyl Inositol 3-Kinase，PI3K）是一类位于细胞质中的脂类激酶。Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，约含480 个氨基酸残基，又称蛋白激酶B[17]。PIP3 可以作为第二信使，能够将Akt 募集到质膜上，促进Akt 发生磷酸化，继而诱导下游分子信号传导[18]。现有研究发现，Rh2 能够通过抑制PI3K/Akt 通路，激活p53 信号通路，促进Caspase-3 表达，导致Bcl-2/Bax 比例失调，诱导结肠癌细胞凋亡[19]。另有研究发现，表皮生长因子可以通过激活PI3K/Akt 信号，促进BMSCs 增殖和迁移[20]。基于以往文献报道，我们推测Rh2 促进BMSCs 增殖的作用机制可能涉及PI3K/Akt 信号。通过Western blot 检测结果发现，与对照组相比，Rh2 中剂量组和高剂量组均能够促进PI3K 和p-Akt 表达。结合细胞增殖检测以及PI3K/Akt 蛋白表达检测，与对照组相比，Rh2 高剂量对BMSCs 增殖作用最为明显。为确证Rh2 是通过PI3K/Akt信号通络促进BMSCs增殖，通过采用p-Akt抑制剂LY294002（20、40 μmol/L）处理后结果显示，与Rh2 高剂量组相比，40 μmol/L 的LY294002 能够显著下调p-Akt 表达，抑制BMSCs 增殖。

综上所述，Rh2 能够通过PI3K/Akt 信号通路促进BMSCs 增殖。以上研究结果将为Rh2 用于促进BMSCs 增殖提供新的分析作用机制。