毒痰瘀脾虚方含药血清对HepG2肝癌细胞增殖及VEGF的影响

潘 谊，吴辉坤,2,3*

（1.湖北中医药大学，武汉 430065；2.湖北省中医药研究院，武汉 430074；3.湖北省中医院，武汉 430061）

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率在全球恶性肿瘤中居第6 位，病死率居第2 位[1]。传统的治疗方法除手术及放、化疗外，中医中药在肝癌的治疗中也发挥了重要的作用[2]。在中医上，无“肝癌”这一病名，根据其临床表现，将其归为“积聚”“黄疸”“臌胀”“胁痛”等范畴，目前多称之为“肝积”[3]。关于肝癌证候要素的理论观点有很多，如钱英教授认为肝郁脾肾气血亏，痰湿疫毒为原发性肝癌的基本病因病机[4]。张建军教授认为正气与阴阳平衡在肝癌的发生与发展起着重要作用[5]。魏睿等[6]提出肝癌的病机为脾胃气虚，痰湿瘀互阻。胡文雷等[7]认为本病外因是由感受邪毒、肝郁气滞等引起，而正气亏虚、脏腑功能失调是导致发病的根本所在，正虚以肝、脾、肾三脏虚为主，邪实以瘀血、湿热毒邪为主。湖北省中医院肝病研究所在长期的临床实践和科学研究中，提出了“毒痰瘀虚”为原发性肝癌的证素特点[8]。本研究是基于前期采用HepG2 肝癌荷瘤小鼠模型，针对毒、痰、瘀、虚各证候要素的中药进行筛选和优化，形成中药复方，将中药复方按照证候要素“毒痰瘀虚”的组方特点进行拆方，组方，形成针对毒痰瘀虚不同方面的中药复方，毒痰瘀脾虚方是在证候要素毒痰瘀的基础上，兼顾证候要素脾虚，进行组方而形成的。本研究从细胞实验方面着手，通过CCK8 法观察毒痰瘀脾虚方对HepG2 细胞增殖的影响，ELISA 法观察毒痰瘀脾虚方对HepG2 细胞内皮生长因子（VEGF）表达的影响。

1 实验材料

人肝癌HepG2 细胞，武汉巴菲尔生物技术服务公司提供。SPF 级雄性Wistar 大鼠，体质量180～220 g 购置武汉大学实验动物饲养中心，许可证号：SYXK（鄂）2017-0095。微型高速离心机（美国Labnet，型号：C2500-R-230V）；倒置显微镜（NIKON，型号：Ts2型）；ICV-450 型电热恒温培养箱（日本ASONE，型号：ICV-450）；全自动酶标仪（Thermoscientific，型号：MultiskanMK3）；超净工作台（苏州集团安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-2FD）等。RPMI-1640 培养基（Gibco，货号：C11875500BT）；胎牛血清（GIBCO，货号：10099-141）；人VEGF 酶联免疫吸附测定试剂盒（欣博盛，货号：EHC108）；CCK-8 试剂盒（Beyotime，货号：E1CK-000208）；青霉素-链霉素溶液（双抗，100×）（Procell，货号：PB180120）；PBS（Procell，货号：PB180327）；二甲基亚砜(细胞级)（Sigma-D4540，货号：67-68-5）。毒痰瘀脾虚方由中药叶下珠10 g，半枝莲15 g，白花蛇舌草15 g，天葵子20 g，旋覆花10 g，皂角刺10 g，丹参20 g，姜黄20 g，党参30 g，炙黄芪30 g，白术30 g 组成（剂量参考中药大辞典），中药购自湖北省中医院中药房，由湖北省中医院制剂室加工成浓缩液含生药2 g/mL，4 ℃保存备用；索拉非尼（200 mg/粒）购自德国拜耳制药公司，产品批号：BXHX072。

2 实验方法

2.1 含药血清制备 将Wistar 大鼠随机分为空白对照组、索拉非尼组、毒痰瘀脾虚方组，每组大鼠各3 只。根据人和动物体表面积折算的等效剂量比率表，中药灌胃剂量以10 mL/kg 计算，索拉非尼组以50 mg/kg 的剂量灌胃，每日2 次（每次间隔4 h），连续5 d，于末次给药后1 h，乙醛麻醉，无菌条件下，经腹主动脉采血，冷置1 h 后，离心（2 500 r/min，25 min），分离血清，放置56 ℃水浴中灭活30 min，-20 ℃冰箱保存备用[9-10]。取血清加入RPMI-1640 培养液中，制成含10%含药血清培养液。

2.2 细胞培养 人肝癌HepG2 细胞用含10%胎牛血清RPMI-1640 培养液在37 ℃5%CO2培养箱中常规培养，细胞长到80%时，加入1～2 mL 胰蛋白酶消化细胞进行传代，取对数生长期的细胞用于实验。

2.3 实验分组 实验分为空白对照血清组、索拉非尼含药血清组、毒痰瘀脾虚方含药血清组。

2.4 CCK8 法检测细胞增殖 取对数生长期良好的HepG2 细胞，0.25%胰酶消化后，用RPMI-1640 培养基（10%FBS+1%双抗）调整细胞密度到5×104/mL，接入96 孔板，每组3 个复孔，每孔100 μL 细胞悬液，并设置空白孔，在细胞孔周围孔内加入100 μL 无菌PBS，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养过夜。细胞过夜培养贴壁后，吸去培养基，分别加入200、500、1 000 ng/mL 毒痰瘀脾虚方含药血清培养基，每孔200 μL，5%CO2，37 ℃常规培养，培养24、48、72 h 后，弃掉上清，每孔加入20 μLCCK8，37 ℃培养2～4 h，于450 nm波长处，用酶标仪测定各孔吸光值（OD值），并计算细胞增殖抑制率。细胞生长抑制率（%）＝（空白对照组OD 值－实验组OD 值）/空白对照组OD 值×100%。

2.5 ELISA 检测各组细胞上清液中VEGF 的表达 取对数生长期良好的细胞，0.25%胰酶消化并用台酚蓝染色计数，用含15%胎牛血清RPMI-1640 培养基（10%FBS+1%双抗）制成5×104/mL 的细胞悬液，接种于24 孔培养板中，每组3 个复孔，每孔100 μL 细胞悬液。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。给酶标板覆膜，37 ℃孵育90 min。弃去孔内液体，每个孔中加入生物素化抗体工作液100 μL，酶标板加上覆膜，37 ℃温育1 h。弃去孔内液体，每孔加酶结合物工作液100 μL，加上覆膜，37 ℃温育30 min。弃去孔内液体，每孔加底物溶液100 μL，酶标板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min。每孔加终止液100 μL，终止反应，立即用酶标仪在450 nm 波长测量各孔的光密度（OD 值），绘制标准曲线，计算样品的相应浓度。按照人VEGFELISA 检测试剂盒说明进行操作。

2.6 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计分析软件对数据进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA）。

3 结果

3.1 毒痰瘀脾虚方含药血清对细胞生长抑制的影响 CCK8 检测结果显示，随着药物浓度的升高，毒痰瘀脾虚方含药血清对HepG2细胞的抑制作用越明显，且具有明显的浓度依耐性和时间依耐性，与空白对照组相比差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。见表1、表2。

表1 不同浓度含药血清对HepG2 细胞生长抑制的影响

表2 不同作用时间对HepG2 细胞生长抑制的影响（，n =3）

表2 不同作用时间对HepG2 细胞生长抑制的影响（，n =3）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.01

3.2 毒痰瘀脾虚方含药血清对HepG2 细胞VEGF 表达的影响 见表3。

表3 各组培养液中VEGF 的蛋白浓度（，n =3）ng/mL

表3 各组培养液中VEGF 的蛋白浓度（，n =3）ng/mL

注：与空白对照组比较，## P ＜0.01；与索拉非尼组比较，△△P ＜0.01

4 讨论

原发性肝癌恶性程度高，预后差[11-12]，典型特征就是大量新生血管的形成,并受多种细胞因子的调控，VEGF 是血管形成的重要调节因子，参与肿瘤的形成及发展的多个过程，具有促进新生血管形成，增加血管通透性、促进内皮细胞的增殖、抑制细胞凋亡的生物学功能[13]。肿瘤快速生长的过程中，需要血液供应的支持，VEGF 是促进肿瘤血管生成的核心细胞因子，VEGF 水平的上升或下降标志着肿瘤的形成或减退[14]。肝癌细胞的无限增殖是肝癌难控制的主要原因之一[15]，抑制肝癌细胞的增殖是抑制肝癌发生发展的主要途径之一，许多中药可抑制肝癌细胞增殖，发挥抗肿瘤作用[16-18]。因此，发现具有抑制肝癌细胞增殖和血管生成的中药复方，在中医治疗肝癌方面具有重要意义[19-20]。

肝癌的证候要素是毒痰瘀虚，肝癌的发生发展多由于正气内虚、阴阳失调，复因感受邪毒、情志郁结、饮食不节、宿有旧疾等因素损伤人体正气，脏腑功能失调，气血津液运行失常，产生气滞、血瘀、痰浊、热毒等病理变化，蕴结于肝脏，相互搏结，日久形成肝癌。在肝癌发生发展的不同时期，毒痰瘀虚四大证候要素的表现轻重不一[16]。周仲瑛教授认为肝癌的病因与癌毒、饮食、情志、外邪、肝病久延、素体禀赋有关，其中癌毒是最根本的原因[21]。张婷等[22]重视脾在肝癌发生中起的重要作用，认为脾虚是根本。刘嘉辉等[23]提出肝癌的病机本质是正虚邪实：正虚以脾虚为突出，邪实以邪气内蕴、热毒血瘀等为突出。林敏等[24]认为，正气虚损、脏腑失调是原发性肝癌发生发展的基本前提；癌毒内生、邪毒盘踞是其发生发展的根本原因；气滞血瘀、络脉痹阻是其发生发展的重要因素；湿热痰浊、诸邪相攻是其发生发展的致病关键。吴云等[25]认为，肝癌是在正气亏虚、脏腑失和的基础上，痰、湿、瘀、毒等各种病理因素相互胶着，日久积滞而发，且邪越盛而正越虚，病变错综复杂。以上各医家对肝癌病因病机的认识侧重点虽有不同，但总的不离肝癌“毒痰瘀虚”的证候要素特点。

中药复方毒痰瘀脾虚方在组方上兼顾了肝癌毒、痰、瘀、脾虚4 个证候要素，其中叶下珠、半枝莲、白花蛇舌草、天葵子针对证候要素“毒”；旋覆花、皂角刺针对证候要素“痰”；丹参、姜黄针对证候要素“瘀”；党参、黄芪针对证候要素脾气虚；全方共奏解毒、化痰、祛瘀、补益脾气之效。

本研究运用血清药理学方法[26]在大鼠中获得毒痰瘀脾虚方含药血清，通过CCK8 法和ELISA 法证实了毒痰瘀脾虚方具有抑制细胞增殖活性和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，抑制血管生成的作用（P＜0.01）。