电针“水沟穴”对急性脑梗死大鼠星形胶质细胞的影响

彭亚婷，莫燕丽，陈书俞，王 凡，刘建浩

（1.广州中医药大学，广州 510000；2.上海中医药大学，上海 200000；3.三亚市中医院，海南 三亚 572000）

脑梗死作为一种脑组织局灶性病变，临床诊治过程中通常可以通过临床的体格检查及影像学检查做出明确的定位诊断。而早在1870 年Brown-Sequard 就发现脑局灶性损害时在远离病灶区域往往呈现脑功能紊乱的现象[1-2]。本研究将观察针刺水沟穴对急性脑梗死大鼠海马组织星形胶质细胞GFAP（glial fibrillary acidic protein，胶质纤维酸性蛋白）、EAAT2（GLT，glial glutamate transporter，谷氨酸转运蛋白2）表达的影响，基于星形胶质细胞探讨针刺水沟穴治疗急性脑梗死的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF 级健康成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠45 只，体质量220～280 g，上海中医药大学动物中心提供（序号：0009740，许可证号码：SCXK（沪）2018-0004）。随机将大鼠分为假手术组、模型组及水沟穴组，每组于造模成功后按第6、24、72 h 再分3 个亚组，每亚组5 只。实验过程中对动物的各项处理均符合我国科技部颁发的关于实验动物的伦理学规定。

1.2 主要仪器与试剂 一次性无菌针灸针（华佗牌一次性针灸针，0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司），HANS-200E 韩氏穴位神经刺激仪（南京济生医疗科技有限公司），实时定量荧光PCR 仪（美国ABI 公司），微型高速离心机（Mini-14k 常州迈科诺仪器有限公司），石蜡脱水机、包埋机、摊片机（常州市雅博电子设备有限公司），倒置荧光显微镜、成像系统（日本尼康）。TRIzol Reagent（Invitrogen 155596-026），氯仿、异丙醇（国药集团化学试剂有限公司），PH 值9.0 抗原修复液、PH 值8.0 抗原修复液、PH 值6.0 柠檬酸抗原修复液、PBS 缓冲液（上海代轩生物科技有限公司）免疫组化试剂盒、DAB 显色剂（VECTOR SK-4105）。

1.3 造模方法 模型组与水沟穴组采取改良Zea-Longa线栓法[3]制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型（MCAO）。参考Longa的5分制法在大鼠麻醉清醒后24 h进行评分。

1.4 针刺方法 针刺治疗于造模成功后开始实施。操作者用0.5 寸针于水沟穴处进针，即在人中沟中央的上1/3 与下2/3 交界处向上斜刺2 mm，并在该部位下约2 mm 处刺入一针作为参考电极。针灸针连接韩氏穴位神经刺激仪进行针刺治疗：选择电针模式，水沟穴接电针仪负极，参考电极接正极，用5 HZ、2 mA、连续波电刺激持续30 min。每天治疗1 次，分别治疗各亚组相应天数。

1.5 观察指标及检测方法 大鼠处死后取出海马组织。荧光定量PCR 技术检测GFAP、EAAT2 基因mRNA 表达：用trizol 进行mRNA 的提取，提取出的mRNA进行逆转录，成为cDNA模板。以cDNA为模板，进行real time PCR 实验。免疫组织化学法观察GFAP、EAAT2 蛋白表达：石蜡切片脱蜡至水。阻断内源性过氧化物酶，抗原修复，血清封闭，加一抗、二抗。DAB 显色，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，蒸馏水冲洗切片终止显色。复染细胞核，脱水封片。最后记录染色强度和阳性细胞数。

1.6 免疫组化评分标准 染色强度评分标准：无染色（0 分），浅黄色（1 分），浅棕色（2 分），棕黄色（3 分）；阳性细胞数评分标准：细胞染色强度≤5%（0 分），≤25%（1 分），≤50%（2 分），≤75%（3分），≤100%（4 分）。免疫组化总评分=染色强度评分+阳性细胞数评分。

2 结果

2.1 各组大鼠神经行为学Longa 评分 见表1。

表1 各组大鼠神经行为学Longa 评分比较（，n =5）

表1 各组大鼠神经行为学Longa 评分比较（，n =5）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.2 荧光定量PCR 分析结果

2.2.1 各组大鼠海马组织中GFAP mRNA 表达 见表2。

表2 海马组织中GFAP mRNA 表达（，n =5）

表2 海马组织中GFAP mRNA 表达（，n =5）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.2.2 各组大鼠海马组织中EAAT2 mRNA 表达 见表3。

表3 海马组织中EAAT2 mRNA 表达（，n =5）

表3 海马组织中EAAT2 mRNA 表达（，n =5）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.3 免疫组化分析结果

2.3.1 各组大鼠海马组织中GFAP 免疫组化标记结果方差分析结果显示（图1），6、24、72 h 3 个时间点，与模型组比较，水沟穴组GFAP蛋白表达量显著降低（P＜0.05），与假手术组比较，6、72 h 模型组GFAP 蛋白表达量均显著增加（P＜0.05），6、24、72 h 3 个时间点，水沟穴组GFAP 蛋白表达量与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 GFAP 蛋白表达

2.3.2 各组大鼠海马组织中EAAT2 免疫组化标记结果 方差分析结果显示（图4），6、24、72 h 3个时间点，与模型组比较，水沟穴组EAAT2 蛋白表达量显著降低（P＜0.05），与假手术组比较，6 h 模型组EAAT2 蛋白表达量均显著增加（P＜0.05），与假手术组比较，72 h 水沟穴组EAAT2 含量显著降低（P＜0.05），6、24 h 水沟穴组EAAT2 蛋白表达量与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 EAAT2 蛋白表达

3 讨论

星形胶质细胞是脑和脊髓中特有的胶质细胞。星形胶质细胞的功能包括：对形成血脑屏障的内皮细胞的生物支持，向神经组织提供营养，在钙离子介导下将线粒体释放至细胞外以提高邻近神经元存活率[4]，以及对脑损伤后脑和脊髓的修复和瘢痕形成的作用[5]等。当急性脑梗死发生后，星形胶质细胞可以通过代谢支持、抗氧化以及分泌神经保护物质发挥神经保护作用[6]，如星形胶质细胞可以通过谷氨酸转运体摄取突触间隙中过量的谷氨酸，发挥神经保护作用[7]，同时ATP 受体（P2 受体）在星形胶质细胞中高度表达，在缺血、缺氧条件下，星形胶质细胞外ATP 浓度升高，ATP 通过激活ATP 受体，释放谷氨酸，参与兴奋毒性，此时较低浓度P2 受体拮抗剂就可以有效阻止神经元损伤[8]。当发生急性脑梗死时，海马CA1 区椎体神经元对缺血缺氧伤害极为敏感，是脑神经损伤最常受累部位[9]。杜一星等[10]研究发现，在MCAO 大鼠模型造模后4 h 缺血侧SD 波由梗死区向远隔区域海马结构扩散，利用CSD 阻滞剂MK-801 后海马神经元损伤显著减轻。GFAP 是公认的星形胶质细胞特异性标志物，在脑缺血损伤过程中，高表达GFAP 蛋白可吞噬细胞外的有害的神经介质，保持内部环境稳定[12]。脑梗死急性期半暗带区GFAP 表达明显增加可改善脑缺血时局部脑血流，促进星形胶质细胞增值[13]。EAAT1 和EAAT2 是哺乳动物中枢神经系统谷氨酸转运蛋白的主要形式，EAAT2 在海马和大脑皮层含量最丰富。

水沟穴是“醒脑开窍”针法的主穴之一[14]，脑梗死急性期针刺水沟穴可醒脑神、开清窍[11，15]。其作用机制为通过针刺水沟穴激活三叉神经—脑血管系统，兴奋脑神经元，改善脑血流[16-17]。有研究证实针刺水沟穴对PKC 蛋白水平和活性进行调节[18]。此外，电针水沟穴可改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能[19]。可能通过降低脑缺血再灌注大鼠海马CA1 区L-Ca2+通道的电流幅度，减少L-Ca2+通道开放时间，抑制神经细胞内钙超载的作用，促进脑缺血再灌注大鼠神经功能的恢复[20]。从实验结果可以初步推断，针刺水沟穴可以减少有害神经介质以保护脑神经进一步受损，适时调控GFAP、EAAT2 的分泌量，通过针刺干预使星形胶质细胞中GFAP、EAAT2 在不同病程阶段表现出不同程度的蛋白表达。