托芬那酸通过下调LOXL2表达抑制人胃癌SGC-7901细胞侵袭①

程 琦 徐松涛 饶淑梅 马永超

(漯河医学高等专科学校，漯河 462002)

胃癌是威胁人类生命健康的主要恶性肿瘤之一。全世界每年死于胃癌的患者约78.3万例，死亡率仅次于肺癌，位居恶性肿瘤谱第二位[1]。我国每年新增胃癌患者约67.9万例，死亡49.8万例，成为我国癌症死亡的第二大原因[2]。90%以上癌症患者的死亡是由肿瘤细胞侵袭和远处转移导致的[3]。因此侵袭和转移是影响胃癌治疗效果和生存预后的重要制约因素。托芬那酸(tolfenamic acid,TA)是一种广泛应用的非甾体抗炎药，具有抗炎、镇痛、解热等作用[4]。近年来，TA对癌症的化学预防作用已获大量临床和流行病学证据支持[5]。多项研究证实，TA可通过抑制转录因子特异性蛋白1 (specificity protein 1,SP1)表达发挥抗肿瘤作用，包括神经母细胞瘤、结肠癌、卵巢癌、尤文肉瘤和胰腺癌等[6-10]。赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysyl oxidase-like 2,LOXL2)是受SP1调控的下游分子，在胃癌的侵袭和转移过程中发挥重要作用[11-13]。但目前关于TA对胃癌细胞迁移和侵袭的作用鲜有报道。本研究拟通过分子生物学方法观察TA对人胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭的影响，并探究其可能的生物学机制。

1 材料与方法

1.1材料 人胃癌SGC-7901细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培养基购自Hyclone公司；TA购自Selleck公司；CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物公司；结晶紫染色液、TRIzol试剂、RIPA裂解液和ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Matrigel基质胶和Transwell小室购自Corning公司；靶向LOXL2的shRNA干扰质粒(pRS-LOXL2)和无义对照质粒(pRS-scrambled)购自美国Origene公司；脂质体(Lipofectamine®2000)购自Invitrogen公司；逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒购自大连宝生物公司；兔抗人SP1、LOXL2、Snail、E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、GAPDH单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Abcam公司；LOXL2、GAPDH引物由大连宝生物公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养 SGC-7901细胞用含10% FBS的RPMI1640培养液置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养；每2 d换液1次，待细胞覆盖率达到90%时按1∶3比例传代1次。

1.2.2药物配制 将TA溶于二甲基亚砜(DMSO)制成100 mmol/L的储备液。实验前用完全培养液稀释至所需浓度，其中DMSO的终浓度为0.1%，对照组为含0.1% DMSO的细胞培养液。

1.2.3CCK-8法检测细胞活力 将SGC-7901细胞以5 000个/孔接种于96孔板，常规培养24 h；去上清，加入100 μl含不同剂量TA(0、3、6、12、24、48、96 μmol/L)的细胞培养液，每个剂量设5个复孔，常规培养24 h或48 h；每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育1 h，用酶标仪检测各孔450 nm处OD值；依据公式计算细胞活力，细胞活力(%)=(OD药物组/OD对照组)×100%，采用SPSS18.0软件的Probit回归模型计算半数抑制浓度(IC50)。

1.2.4Transwell法检测细胞侵袭 以不同剂量TA(0、3、6、12 μmol/L)处理SGC-7901细胞24 h，然后收集各组细胞，用无血清RPMI1640培养基制成密度为2×105个/ml的细胞悬液；用RPMI1640培养基按1∶5比例稀释Matrigel基质胶，取50 μl加至上室底部，37℃孵育1 h；下室中加入600 μl含10% FBS的RPMI1640培养基，上室中加入200 μl细胞悬液，在37℃、5 % CO2条件下培养24 h；用棉签擦去上室内的细胞，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min；显微镜下计数上室下表面附着的侵袭细胞。

1.2.5质粒转染 用Lipofectamine®2000将质粒pRS-LOXL2和pRS-scrambled分别转染SGC-7901细胞，细胞转染按说明书进行；转染pRS-LOXL2质粒的SGC-7901细胞命名为shLOXL2组，转染pRS-scrambled质粒的SGC-7901细胞命名为shControl组；转染48 h后，收集各组细胞进行后续实验。

1.2.6RT-PCR检测mRNA水平 用TRIzol试剂提取总RNA，取2 μg总RNA进行反转录，反转录条件：42℃ 60 min，70℃ 15 min。取2 μl进行PCR反应，反应条件为：94℃ 1 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32个循环。引物采用Primer premier 5.0软件设计，经Blast验证。LOXL2上游引物：5′-CTGCAAGTTCAATGCCGAGT-3′，下游引物：5′-AGTTTTGGCCACACACCATC-3′；GAPDH上游引物：5′-AATTCCATGGCACCGTCAAG-3′，下游引物：5′-GGGCAGAGATGATGACCCTT-3′。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照。

1.2.7Western blot法检测蛋白水平 收集各组细胞，加入RIPA裂解细胞提取总蛋白，采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度；用5×上样缓冲液稀释蛋白样本，沸水浴10 min，SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入一抗LOXL2(1∶1 000稀释)、Snail(1∶1 000稀释)、E-cad(1∶1 000稀释)、MMP9(1∶1 000稀释)和GAPDH(1∶2 000稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗膜2次；加入二抗(1∶5 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗膜2次；加入ECL工作液进行发光反应，用化学发光成像系统分析仪拍照。

2 结果

2.1TA对SGC-7901细胞活力的影响 如图1所示，经不同剂量TA作用24 h或48 h后，与对照组相比，24、48和96 μmol/L TA组细胞活力均显著降低(P<0.05)，且随药物剂量的增加呈下降趋势；3、6和12 μmol/L TA组细胞活力与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。24 h和48 h的IC50分别为78.06 μmol/L和50.72 μmol/L。

图1 TA对SGC-7901细胞活力的抑制作用Fig.1 Inhibiting effect of TA on cell viability of SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 24 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 48 μmol/L TA group.

2.2TA对SGC-7901细胞侵袭的影响 如图2所示，与对照组相比，3、6和12 μmol/L TA组侵袭细胞数均显著减少(P<0.05)，且随着药物剂量的增加而减少(P<0.05)。

图2 TA抑制SGC-7901细胞侵袭Fig.2 TA suppressed invasion of SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 3 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 6 μmol/L TA group.

2.3TA对侵袭相关蛋白水平的影响 如图3所示，与对照组相比，经不同剂量TA(3、6、12 μmol/L)处理24 h后，SGC-7901细胞中Snail、MMP9、SP1和LOXL2蛋白水平均显著下降(P<0.05)，且随TA剂量的增加呈下降趋势(P<0.05)；E-cad蛋白水平则随TA剂量的增加逐渐升高(P<0.05)。

图3 TA对SGC-7901细胞中Snail、E-cad、MMP9、SP1和LOXL2蛋白水平的影响Fig.3 Effect of TA on protein levels of Snail,E-cad,MMP9,SP1 and LOXL2 in SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 3 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 6 μmol/L TA group.

2.4TA对LOXL2的mRNA水平的影响 如图4所示，与对照组相比，3、6和12 μmol/L TA组LOXL2的mRNA水平均显著下降(P<0.05)，且随TA剂量的增加呈下降趋势(P<0.05)。

图4 TA剂量依赖性下调LOXL2的mRNA水平Fig.4 TA down-regulated mRNA level of LOXL2 in a dose-dependent mannerNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 3 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 6 μmol/L TA group.

2.5敲除LOXL2基因对侵袭相关蛋白水平的影响 如图5所示，与shControl组相比，shLOXL2组LOXL2、Snail和MMP9蛋白水平均显著下降(P<0.05)，E-cad蛋白水平显著升高(P<0.05)。

图5 敲除LOXL2基因对LOXL2、Snail、E-cad和MMP9蛋白水平的影响Fig.5 Effect of LOXL2 gene knockout on protein levels of LOXL2,Snail,E-cad and MMP9Note:*.P<0.05 vs shControl group.

2.6敲除LOXL2基因对SGC-7901细胞侵袭的影响 如图6所示，与shControl组相比，shLOXL2组侵袭细胞数明显减少(P<0.05)。

图6 敲除LOXL2基因抑制SGC-7901细胞侵袭Fig.6 Knockout of LOXL2 gene inhibited invasion of SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs shControl group.

3 讨论

有研究证实，TA可通过下调Slug蛋白表达抑制人鼻咽癌细胞迁移和侵袭[14]。本研究显示，高剂量TA(>12 μmol/L)对人胃癌SGC-7901细胞活力具有显著抑制作用，并呈现剂量和时间依赖性。为避免细胞活力受损对细胞侵袭能力的影响，本实验采用低剂量TA(3、6、12 μmol/L)处理SGC-7901细胞24 h，然后行Transwell实验检测细胞侵袭。结果显示，TA可剂量依赖性地抑制SGC-7901细胞侵袭，这可能与其下调SP1、LOXL2、Snail和MMP9蛋白水平，上调E-cad蛋白水平有关。

多项研究表明，LOXL2在恶性肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥重要作用，包括胰腺癌、乳腺癌、肾癌和肝癌等[15-18]。Kasashima等[13]研究表明，胃癌病理组织中LOXL2蛋白水平与局部侵袭范围、淋巴结转移、肝转移和腹膜转移呈正相关，敲除LOXL2基因可显著抑制人胃癌OCUM-12细胞和NUGC细胞侵袭。动物实验也证实，抑制LOXL2可阻止裸鼠胃癌移植瘤向肺转移[12]。本研究显示，TA可剂量依赖性地下调SGC-7901细胞中LOXL2的mRNA水平，敲除LOXL2基因可抑制SGC-7901细胞侵袭并下调Snail和MMP9蛋白水平并上调E-cad蛋白水平。

E-cad是一种钙依赖性跨膜糖蛋白，其胞内段通过连环素锚定在细胞骨架上，使相邻细胞形成稳定连接，其表达下调或缺失是肿瘤细胞发生上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的重要标志之一。研究表明，E-cad蛋白表达上升会导致癌细胞侵袭能力减弱[19]。敲除LOXL2基因可上调肾癌细胞中E-cad蛋白表达从而抑制其迁移和侵袭[17]。Snail是一种具有锌指结构的转录因子，可直接结合E-cad基因启动子的E-box作用元件，从而抑制其表达[20]。LOXL2高表达可通过上调Snail蛋白表达促进肝癌细胞侵袭和转移[18]。Zhu等[21]研究证实，下调Snail蛋白和上调E-cad蛋白会抑制人胃癌SGC-7901细胞侵袭。本研究表明，TA可能通过下调LOXL2/Snail通路促进E-cad蛋白表达，这可能是TA抑制SGC-7901细胞侵袭的机制之一。

Hong等[17]研究证实，敲除LOXL2基因可抑制肾癌细胞中MMP9蛋白表达。MMP9属基质金属蛋白酶超家族成员，可高效降解Ⅳ型胶原蛋白。Ⅳ型胶原蛋白是构成细胞外基质和基底膜的主要成分，而细胞外基质和基底膜是防御恶性肿瘤细胞向周围组织侵袭的天然屏障。恶性肿瘤细胞可通过分泌MMP9破坏细胞外基质和基底膜的完整性，侵犯周围组织、进而侵入血管和淋巴管向远处转移。Wei等[22]研究显示，上调MMP9蛋白表达可增强SGC-7901细胞的侵袭能力。本研究表明，TA可剂量依赖性地抑制MMP9蛋白表达，这可能与TA下调LOXL2表达有关。

综上所述，TA可在体外抑制人胃癌SGC-7901细胞侵袭，这可能与其抑制SP1和LOXL2表达，进而下调Snail和MMP9蛋白水平，上调E-cad蛋白水平有关。本研究为丰富TA的抗肿瘤侵袭作用提供新的实验依据。