强化谷氨酰胺及合生元的肠内营养对结肠炎新生小鼠Treg/Th17免疫平衡的影响①

丰 暖 朱 艳 霍圆圆 王建新 滕 倩

(青岛市妇女儿童医院营养科，青岛 266000)

常见于消化科的炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种累及结肠、直肠，并且容易反复发作的慢性疾病[1]。目前该病的发病机制尚未完全阐明，Li等[2]研究显示结肠黏膜的免疫功能异常在IBD患者延绵反复的炎症应激中发挥重要作用。调节性 T 细胞(regulatory T， Treg)是具有独特免疫调节功能的淋巴细胞，在叉状头/翅膀状螺旋转录因子3(forkhead winged-helix transcription factor,Foxp3)的诱导下，分泌TGF-β1、IL-10等因子以减弱、抑制或终止炎症应激的进展，Th17细胞是具有强烈促炎效应的淋巴细胞，能够分泌IL-17、IL-23等促炎因子，活化转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(retinoic acid-related nuclear orphan receptor γt,RORγt)传递炎症信号，诱导多种慢性炎症性疾病的发展[3]。张慧俭等[4]研究显示Treg/Th17免疫失衡与结肠炎症性损伤关系密切。程序性死亡分子-1(programmed death-1,PD-1)及其主要配体(programmed death-1 ligand,PD-L1)信号通络是机体内重要的与免疫调节相关的通路。Cassol等[5]研究证实PD-1抑制剂能明显改善溃疡性大鼠肠道的炎症应激。但未见有PD-1/PD-L1信号在结肠炎肠黏膜Treg/Th17免疫平衡中的报道。国内外的诸多专家一致认为强化谷氨酰胺的肠内营养是针对IBD患者恢复免疫调节的首选治疗方法[6]。谷氨酰胺是肠黏膜修复的重要营养物质，肠道黏膜修复过程中对谷氨酰胺的需求量加大，若不能及时补充，IBD患者的肠道黏膜结构将难以恢复。本研究通过葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导小鼠IBD 模型，从PD-1/PD-L1信号入手，探讨强化谷氨酰胺及合生元的肠内营养对IBD小鼠Treg/Th17免疫平衡的调节，为临床上结肠炎的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 7～8周龄的SPF级BALB/c雄性小鼠共计60只，体质量(18.33±0.63)g，购自北京维通达生物技术有限公司，动物使用许可证号： SYXK(京)2019-0025；实验动物按照本院动物管理规定适应性喂养1周后进行实验。

1.1.2主要试剂和仪器 百普素(125 g/袋，德国Milupa GmbH公司，批准文号：H20170170)；复方谷氨酰胺肠溶胶囊(24 s/盒，地奥集团成都药业股份有限公司，国药准字H51023598)；合生元粉剂(5 g/袋，西安力邦临床营养有限公司)；PD-L1 Fc 融合蛋白(1 mg/袋，美国Chimerigen公司)；苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)试剂盒购自Sigma公司；免疫组化试剂盒购自美国Selleck公司；Western blot试剂盒购自美国PALL公司；冰冻切片包埋剂购自美国樱花公司；PBS缓冲液购自美国Abcam公司；苏净Airtech超净工作台(北京六一仪器厂)；LEICAEG1150组织包埋机(德国Leica公司)；Nikon Ti-U/Ti-s荧光显微镜(日本三菱公司)；5810R 型高速离心机(日本岛津公司)；流式细胞仪(美国Beckma公司)。

1.2方法

1.2.1实验性结肠炎小鼠模型的构建 适应性喂养1周后，按照随机数字表法将小鼠分为正常组(Normal,Nor)、模型组(Model,Mod)、对照组(Control,Con)和实验组(Experiment,Exp)。Nor组小鼠每天自由饮用纯净水，Mod组、Con组、Exp组每天自由饮用含5% DSS的纯净水，连续2周后，模型小鼠出现大便稀软、黏液血便、腹部肿大以及厌食等现象，视为造模成功[7]。

1.2.2分组喂养 将25 g百普素(短肽型肠内营养制剂)溶于100 ml纯净水，制成百普素混悬液。将1 mg PD-L1 Fc 融合蛋白溶于1 ml无菌超纯水。Nor组、Mod组小鼠始终以基础饲料连续喂养，Con组小鼠以基础饲料添加1 mg/kg的PD-L1 Fc 融合蛋白，Exp组小鼠以基础饲料添加100 ml/kg百普素、0.5 g/kg谷氨酰胺和0.5 g/kg合生元，于标准饲养房饲养14 d[8]。

1.2.3各组小鼠在造模过程中疾病活动指数评分 造模开始后每天记录各组小鼠的一般状态、体质量以及大便情况，进行疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分，评分标准如下：体质量下降情况：无体质量下降记为0分，体质量下降1%～5%记为1分，体质量下降6%～10%记为2分，体质量下降11%～15%记为3分，体质量下降15%以上记为4分；大便情况：正常记为0分，松散记为1分，稀便记为3分；无血便记为0分，隐血便记为2分，肉眼可见血便记为4分；3项目积分的总和除以3即为DAI评分[9]。

1.2.4各组小鼠血清指标的测定 连续喂养7 d后，小鼠经腹静脉采血5 ml，离心取血清，立即转入-80℃低温冰箱保存。在1周内严格按照试剂盒要求检测TGF-β1、IL-17含量。

1.2.5各组小鼠的结肠形态观察以及形态损伤比较 采血完毕后，处死动物，无菌剥离小鼠的结肠组织，对比各组小鼠的结肠长度，将结肠纵向剖开后，肉眼观察各组小鼠结肠黏膜增生、糜烂情况。根据结肠黏膜组织损伤(colon macroscopic damage index， CMDI)对各组小鼠的结肠进行评分，标准如下：大体形态无损伤记为0 分；结肠表面光滑但有轻度充血、水肿，无糜烂点记为1 分；结肠黏膜粗糙，充血水肿，多处糜烂或黏连记为2 分；结肠黏膜出现坏死点，多处溃疡，肠壁增厚以及炎症明显，但溃疡纵径最大在1 cm以内，充血水肿严重，记为3 分；全肠壁坏死严重，黏膜坏死，结肠黏膜多处出血点，溃疡纵径最大大于1 cm，记为4 分。观察完毕后将各组小鼠的结肠组织迅速转移到惰性气体罐中，-80℃低温冰箱独立保存待测[10]。

1.2.6HE染色观察各组小鼠结肠组织病理改变 取出长度约0.5 cm的结肠组织标本，以多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，观察各组小鼠结肠组织的病理改变。

1.2.7免疫组化检测各组小鼠结肠组织中RORγt和Foxp3表达 取出长度约0.5 cm的结肠组织标本，以10%中性甲醛固定，包埋，切片，脱蜡，去除内源性过氧化物酶，PBS修复抗原，加入一抗(1∶100)4℃孵育过夜，次日加入二抗(1∶500)室温孵育，DAB显色，苏木素复染，乙醇梯度脱水，二甲苯浸泡，中性树胶封片，镜检观察并记录实验结果；用图像分析软件系统分析RORγt和Foxp3的阳性细胞比例。

1.2.8流式细胞术检测各组血清中Treg、Th17细胞变化 取出各组小鼠部分血清，采用机械方法获取单个核细胞悬液并稀释，流式细胞术测定结肠组织中Treg、Th17的计数变化。

1.2.9Western blot检测各组小鼠结肠组织中PD-1、PD-L1蛋白表达 取出长度约0.5 cm的结肠组织标本，组织匀浆后，常规提取目标蛋白PD-1、PD-L1，并测定其浓度，准确量取50 μg目的蛋白进行电泳分离，转膜，封闭，稀释(1∶1 500)，低温孵育过夜，加入二抗孵育3 h， 显色，封片后，凝胶成像系统采集图像(GAPDH作为内参)[11]。

2 结果

2.1各组小鼠造模过程大体观察以及疾病活动度评分 在实验过程中，Nor组小鼠的生长状况良好，饮食积极，活泼机警，皮毛光亮顺滑，排泄规律，大便成形，肛周未见明显的附着物；Mod组小鼠从造模第1天开始出现活动量减少、大便次数增多现象，逐渐出现腹泻、软便、精神萎靡等现象，肛周黏便附着明显，后期小鼠厌食明显、皮毛粗糙、暗淡无光、喜好蜷缩扎堆，活动量明显减少。Con组和Exp组小鼠的症状较Mod组明显改善，小鼠肛周较为干净，皮毛较为规整，光滑度明显好转，实验后期饮食量明显回升。与Nor组相比，Mod组小鼠DAI评分明显升高(P<0.05)，与Mod组相比，Exp组和Con组的DAI评分明显降低(P<0.05)，Exp组和Con组评分差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 各组小鼠疾病活动度比较情况Fig.1 Comparison of disease activity of mice in each groupNote:Compared with Nor group,*.P<0.05；compared with Mod group，#.P<0.05.

2.2各组小鼠结肠组织形态比较 Nor组小鼠的结肠细长且弹性良好，未见明显病变。Mod组小鼠结肠明显变短，黏膜充血、糜烂明显，肠壁脆性增加，表面有多个出血点，Exp组和Con组小鼠结肠炎症较Mod组明显改善。与Nor组相比，Mod组小鼠CMDI评分明显升高，结肠长度明显变短(P<0.05)，与Mod组相比，Exp组和Con组CMDI评分明显降低，结肠长度明显增长(P<0.05)，Exp组和Con组差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 各组小鼠结肠组织形态、黏膜损伤以及结肠长度比较Fig.2 Comparison of colon tissue morphology,mucosal injury and colon length of mice in each groupNote:Compared with Nor group,*.P<0.05；compared with Mod group，#.P<0.05.

2.3各组小鼠的结肠组织病理学变化 HE 染色结果显示，Nor组小鼠结肠组织黏膜结构完整，细胞排列规整，杯状细胞形态正常， 未见溃疡、炎症浸润等现象。Mod组小鼠结肠组织杯状细胞数量明显减少，黏膜上皮细胞脱落、坏死明显，基膜成片裸露，可见溃疡点，黏膜细胞水肿明显，大量炎症细胞浸润，细胞核明显增大；Exp组和Con组内结肠组织黏膜上皮病理损伤明显缓解，杯状细胞虽有少量变形，但黏膜区域的炎症细胞浸润明显减少，见图3。

2.4各组小鼠血清学指标 试剂盒检测结果显示，与Nor组相比，Mod组小鼠血清中TGF-β1含量明显降低，IL-17含量明显升高(P<0.05)；与Mod组相比，Exp组和Con组小鼠血清中TGF-β1含量明显升高， IL-17含量明显降低(P<0.05)，Exp组和Con组差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图4 各组小鼠血清中TGF-β1、IL-17的含量Fig.4 Contents of TGF-β1 and IL-17 in serum of mice in each groupNote:Compared with Nor group,*.P<0.05；compared with Mod group，#.P<0.05.

2.5免疫组化检测各组小鼠结肠组织中RORγt、Foxp3的表达 免疫组化显示，与Nor组相比，Mod组小鼠结肠组织中的RORγt阳性细胞比例明显升高，Foxp3阳性细胞比例明显降低(P<0.05)，与Mod组相比，Exp组和Con组小鼠结肠组织中RORγt阳性细胞比例明显降低，Foxp3阳性细胞比例明显升高(P<0.05)，Exp组和Con组差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

图5 各组小鼠结肠组织中RORγt和Foxp3的表达(×400)Fig.5 Expressions of RORγt and Foxp3 in colon tissue of each group of mice (×400)Note:A.RORγt;B.Foxp3.Compared with Nor group,*.P<0.05;compared with Mod group，#.P<0.05.

2.6流式细胞术检测各组小鼠血清中Treg、Th17细胞变化 流式细胞术结果显示，与Nor组相比，Mod组小鼠外周血中Th17细胞占CD4T细胞的比例明显升高，Treg细胞比例明显下降(P<0.05)，与Mod组相比，Exp组和Con组小鼠外周血中Th17细胞占CD4T细胞的比例明显下降， Treg细胞比例明显升高(P<0.05)，Exp组和Con组比例差异无统计学意义(P>0.05)，见图6。

图6 各组小鼠外周血中Th17及Treg细胞比例的变化Fig.6 Percentage changes of Th17 and Treg cells in peripheral blood of mice in each groupNote:A.Th17;B.Treg.Compared with Nor group,*.P<0.05;compared with Mod group，#.P<0.05.

2.7Western blot检测各组小鼠结肠组织中PD-1、PD-L1蛋白的表达 Western blot结果显示，与Nor组相比，Mod组小鼠结肠组织中PD-1、PD-L1蛋白表达均明显升高(P<0.05)， 与Mod组相比， Exp组和Con组小鼠结肠组织中PD-1、PD-L1蛋白表达明显降低(P<0.05)，Exp组和Con组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图7。

图7 各组小鼠结肠组织中PD-1、PD-L1蛋白的表达Fig.7 Expressions of PD-1 and PD-L1 protein in colon tissue of each group of miceNote:Compared with Nor group,*.P<0.05;compared with Mod group，#.P<0.05.

3 讨论

在临床上IBD主要表现为腹泻、腹痛、黏血便、脓血便以及肛周病变，该病主要的并发症为肠穿孔、肠梗阻、肛瘘以及感染性休克、结肠癌变等，现有的治疗手段已陷入瓶颈期，虽能较好地控制IBD的症状， 但是未能改善患者的免疫功能，且在服用西药过程中的不良反应及疾病的反复发作给患者带来沉重的心理压力和经济负担[12，13]。因此临床上迫切需要一种既能控制炎症发展，又能提高患者免疫功能的治疗方法。肠内营养支持是临床上改善IBD患者免疫紊乱的首选治疗手段。但单一的肠内营养支持无法阻止患者的肠黏膜萎缩，改善患者肠黏膜的免疫功能[14]。因此在此基础上探讨合适的肠内营养方式，减小病症对患者肠道黏膜的损伤在临床上意义重大。

临床症状的改善是衡量IBD治疗效果的关键指标。Adamina等[15]研究报道强化谷氨酰胺以及合生元的肠内营养支持对IBD治疗的安全性以及有效性存在较大的争议。本研究中Exp组动物经该手段干预14 d后，小鼠日常行为较Mod组明显改善，疾病活动度明显降低，结肠黏膜损伤CMDI明显降低，结肠长度有所恢复，结肠组织损伤明显改善，证实了该治疗方式良好的疗效。

Liu等[16]研究指出，Treg/Th17免疫平衡轴异常是肠道黏膜免疫功能紊乱的关键因素，同时也是肠黏膜炎症性应激发生、发展的重要病理基础。作为一种新型的CD4T细胞亚群，Treg细胞和Th17细胞主要分布在机体的脾脏和外周血中。研究表明Treg和Th17细胞在机体内相互制约，相互抑制，维系肠道黏膜的免疫平衡。特异性表达Foxp3的Treg细胞介导分泌抗炎分子TGF-β1、IL-10等，具有正向的免疫调节功能，增强肠道黏膜的免疫耐受能力[17]。在RORγt的调控下分泌IL-17的Th17细胞主要增强促炎细胞因子、趋化因子和黏附因子的表达，推动炎症应激的发展。Guo等[18]研究表明上调外周血中Treg百分比，下调Th17细胞百分比，有利于Treg/Th17免疫平衡的稳态，改善IBD大鼠的肠道黏膜损伤。Yao等[19]研究证实调控Treg/Th17的免疫平衡能明显抑制IBD小鼠的炎症应激，改善其肠道黏膜功能。本研究中Mod组小鼠的Treg/Th17轴明显失去稳态，与之相比，Exp组小鼠的血清中TGF-β1含量、结肠组织中Foxp3、外周血中Treg比例明显升高， 血清中IL-17含量、结肠组织中RORγt、外周血中Th17细胞明显降低，说明经强化谷氨酰胺以及合生元的肠内营养支持干预后，Exp组小鼠的Treg/Th17趋于平衡。

大量动物及临床研究表明PD-1/PD-L1信号与IBD的发生、恶性进展关系密切[20]。Zhou等[21]研究表明在急性结肠炎小鼠中，抑制PD-1/PD-L1信号表达能明显改善实验动物的结肠黏膜Treg/Th17免疫失衡的状态，增强实验动物的免疫耐受能力。Yang等[22]研究证实PD-1/PD-L1信号通路能明显改善小鼠由DSS诱导的结肠炎症状，下调其结肠组织中炎症因子表达。Phatak等[23]研究指出在儿童结肠炎的诊断中，PD-1/PD-L1免疫抑制剂具有方便、快捷、减少疼痛等诸多优势，具有良好的临床应用前景。Song等[24]研究证实PD-L1 Fc融合蛋白能阻断结肠炎小鼠的PD-1/PD-L1信号，抑制Th17活性，发挥其对结肠黏膜的保护作用。本研究采用PD-L1 Fc融合蛋白作为对照，结果表明Con组小鼠的观察指标与Exp组小鼠的差异无统计学意义，推测强化谷氨酰胺以及合生元的肠内营养支持可能通过抑制PD-1/PD-L1信号来调控实验性结肠炎小鼠Treg/Th17的免疫平衡，发挥其对结肠黏膜的保护作用。但是如何将这一治疗手段应用到结肠炎的临床治疗中还需更深入、系统的研究。