基因修饰的骨髓间充质干细胞复合聚乳酸聚羟基乙酸/羟基磷灰石/Ⅰ型胶原双相支架的生物学研究

马钢，刘晓民，丁良甲，刘长路，高博

内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古呼和浩特 010030

关节软骨损伤在临床十分常见，可由外伤、手术、感染和退变等引起，多伴有软骨下骨损伤，修复骨软骨缺损是目前较为棘手的难题。 近几年，由于生物工程和技术的发展迅速， 在修复骨软骨缺损方面组织工程技术进步很大。 将基因修饰的骨髓间充质干细胞，种植到具有三维立体多孔的支架中， 可以模拟骨软骨组织天然结构中各层次的生物结构、力学及化学性质，可与缺损病灶周围的软骨及软骨下骨整合，达到更好的修复缺损目的[1]。 该实验中我们在前期研究的基础上，2018 年1 月—2019 年2 月用两只新西兰白兔实验， 选用PLGA 和HAp 制备出一种新型的仿生双相支架PLGA-HAp-ColⅠ，用以模仿关节内从软骨表面到软骨下骨天然形成的各向异性的梯度结构， 并对其相关结构的特性和部分生物学的特征性进行测定，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验对象:新西兰白兔1～2 只。

1.2 制备方法

1.2.1 采用溶液浇注- 沥滤法制备双相支架 取20 gPLGA溶解于50 mL 丙酮， 将分筛NaCl 晶体为粒径100～300 μm，以质量比为15∶85-加入PLGA 的丙酮溶液中，充分搅拌使NaCl 分散均匀，形成糊状的混合物；将其置入模具中，静置约20 min，混合物表面流平后，稍加挤压成型，即为双相支架的软骨相， 厚度约1 mm。 另取PLGA 和HAp以质量比1∶1 混合溶于丙酮， 同法分筛粒径为300～500 μm 的NaCl 晶体造孔，充分搅拌均匀，形成的糊状物再次倒入上述模具内软骨相的上部，制成骨相，控制厚度约2 mm，静置待混合物表面流平，自然干燥2 d 使溶剂完全挥发。 置入AgNO3溶液除尽NaCl，期间每4～6 h 换液1 次，直至用硝酸银溶液检测不到置换出的水中有氯离子为止。 最后置入真空干燥箱中30℃干燥1～2 d，干燥至恒重。以将模型支架修整成直径为4 mm 厚度为3 mm 的圆柱体结构备用。 以猪皮为原料采用稀酸萃取法制得可溶性胶冻状ColⅠ， 将其均匀涂于已经制备好的双相支架表面，即形成PLGA-HAp-ColⅠ双相支架。

1.2.2 双相支架与BMSCs 相容性 将P3 代兔BMSCs 细胞转染miR-29b inhibitor 基因后，收集细胞悬液，以含10%FBS 的L-DMEM 培养基调整细胞浓度约为1×106细胞/mL。 采用悬滴法滴加在支架表面，培养7 d 后，光镜下观察细胞在双相支架的分布情况。

2 结果

经液体置换法，测得制备的PLGA-HAp-ColⅠ双相支架孔隙率为（82.09±4.0）%，复合实验要求。 将种植基因修饰的BMSCs 支架进行石蜡切片， 应用HE 染色后在光镜下观察可见：大量的细胞在支架上广泛贴附，沿着支架的孔道结构呈导向排列， 上层软骨相内可见圆形或椭圆形细胞贴附，胞质被染成红色，胞核为蓝色，下次骨相内可见圆形或多角形细胞贴附。 电镜扫描可见支架表面空隙内贴附并且聚集了大量的球形或者是多角形的细胞，由此可证实支架与BMSCs 具有良好的相容性。

3 讨论

3.1 组织工程支架的材料

细胞生物学在医学领域的应用具有极其重要的地位，而随着生物材料科学不断地发展，组织工程学方法修复软骨缺损是骨科研究中一种全新的治疗模式， 骨组织工程中将种子细胞与支架材料相复合的研究是当今的研究热点,这一全新的治疗方案将成为解决临床上各种原因造成的骨组织缺损的最有效途径之一[2-3]。 关于支架材料方面目前已经有众多的研究，其中PLGA 是人工合成可降解的高分子材料，应用较为广泛，因其支撑强度足够，对细胞贴附生长起到促进作用，且生物相容性良好，无细胞毒性，所依可作为细胞载体应用于组织工程中，是理想的软骨组织工程支架材料。

羟基磷灰石（HAp）是目前应用和研究最广泛的支架材料之一，具有良好的生物相容性、生物活性、骨传导性和骨诱导性，是公认性能良好的骨修复支架材料，广泛用于骨组织工程修复中。 但是，HAp 也有其不足之处，在力学方面表现为脆性大和韧性差， 易发生折断或碎裂等情况。 近些年的研究中，有学者发现[4]，将HAp 与PLLA 结合制备成复合纳米纤维支架后， 对PLLA 降解所导致的PH值变化可以缓冲，减少组织的炎性反应，并且增加支架对蛋白的吸附能力。 因HAp 具备骨传导和骨诱导的良好特性，所以在软骨下骨层中加入HAp，结合BMSCs 能在缺损部位再生出软骨下骨组织，且生物学性能良好。

Ⅰ型胶原来源广泛、容易获得、免疫源性低，所有的Ⅰ型胶原能自然的溶解于稀酸和稀碱中， 加热到40℃以上后胶原蛋白可变性成单α-链。同时，Ⅰ型胶原生物安全性及生物相容性好、可降解吸收、带有较多功能基因、利于改性、便于加工成多种形状，常作为细胞培养的支架材料。 缺点是降解速率过快，机械强度不足，材料质量批次间差别较大，获得高纯度的胶原费用高[5]。 尽管如此，但是Ⅰ型胶原还在很多组织工程研究中表现出良好的生物相容性，是可以作为或部分作为组织工程中的支架材料的。

3.2 组织工程中双相支架应用

软骨下骨是维持软骨结构稳定的基础， 是软骨修复的关键因素，在软骨下骨发生病变的状态下，新生的软骨与其整合较难，故影响软骨的修复。 双相组织工程支架是新出现的一种新型支架， 较单相支架在力学方面表现出更好的特性，综合了两种或两种以上材料的优点，可以在两层不同的支架内分别种植不同的细胞， 这是同时修复软骨和软骨下骨的重要结构基础。 软骨细胞与成骨细胞在共同培养时，二者可以相互促进，利于植入的支架与周围的组织更好地融合。

实验中我们制备的PLGA-HAp-ColⅠ双相支架，由于PLGA 是支架的主体， 两层支架均由PLGA 材料构成，软骨相为PLGA，骨相为PLGA 与HAp 混合物，支架外为ColⅠ涂层，因而不存在材料之间结合不良的现象。 而且制备双相支架时使用溶液浇注-沥滤法，制备、交联过程中并未导致其内部的化学架构产生变化， 符合了天然骨软骨界面的化学构成。 因此，在阻止关节运动的过程中，发生软骨层与软骨下骨层分离的同时， 还能促使两层支架的紧密结合，避免了发生分离和开裂的现象。 在支架软骨相中含有PLGA 和ColⅠ，空间结构足够，生物相容性良好，对种子细胞的增殖和粘附非常适合。支架软骨下骨相中包含HAp、PLGA 和ColⅠ成分，是较好的骨诱导和骨传导的生物活性材料。 该实验制备的双相支架具有明显的骨相与软骨相以及稳定的界面结构， 并没有在制备过程中发生分层或断裂现象。 实验结果测得，制备的PLGA-HAp-ColⅠ双相支架其孔隙率为（82.09±4.0）%，这和吴思宇[6]等的研究结果基本一致， 他们在实验中制备的多孔支架孔隙率为（91.6±0.3）%。 组织工程的支架中孔径和孔隙率是极为重要的参数，能够对支架的力学性能、生物相容性和降解时间等产生诸多影响。 在实验中发现的孔隙率越低，则代表支架的机械性能越高； 而孔隙率越高会越利于受损部位的骨髓细胞迁移进入，从而修复骨软骨的缺损。

3.3 双相支架的各项特性

生物相容性：实验中制备出的双相支架，其中PLGA、HAp 及ColⅠ成分在诸多实验中已经被证实生物相容性良好。 在对制备好的支架进行生物相容性的测定时发现：石蜡切片实验和后面的电镜扫描结果均发现， 经过基因修饰的BMSCs 在支架上可以广泛且大量的粘附， 并进行增殖，由此足以证明实验中制备的双相支架，生物相容性良好，适合作为组织工程中的细胞载体。

孔径和孔隙率：组织工程的支架中，孔径和孔隙率是两项重要的参数，对支架的生物相容性、力学性能、降解时间等影响力较大。支架的孔隙架构能够决定细胞生长的微环境以及启动组织再生的过程，孔间连通性、孔隙的微观形态、孔径大小和孔隙率等因素均能对细胞的粘附、增殖等生物活性产生影响[7]。 该次实验制备的PLGA-HAp-ColⅠ双相支架，其上层软骨相和下层骨相紧密结合，具有良好的孔隙率，且两层结构性能不同，可以很好的模拟出包括软骨层、 钙化软骨层及软骨下骨层的全层软骨结构层次，对促进新生组织的形成作用优良，更能完全有效地修复关节软骨和软骨下骨缺损。

降解时间： 支架的降解时间和良好的吸收性是支架生物相容性的一项重要参数， 直接影响支架理化性能和修复效果。 最理想的支架降解时间就是能够与再生出新生组织的时间良好衔接， 在早期可以为缺损区的新生组织提供附着和支撑， 而在新生组织完全形成的时候就基本降解完全，避免影响新生组织的再生[8]。 研究前期活体内的降解实验中我们发现， 制备的支架没有任何的组织毒性，也无诱发机体异物炎症的反应，且能与周围组织进行良好相容，能够在体内逐渐降解，降解速度能满足关节软骨和软骨下骨再生要求。

4 结论

在实验中制备出的PLGA-HAp-ColⅠ双相支架，制备方法简单，且两层支架之间结合紧密，可模拟骨软骨界面的组织特性。 支架具备空间导向控制细胞分布的能力，与转染miR-29b inhibitor 后的BMSCs 的生物相容性良好，有利于基因修饰的BMSCs 吸附、增殖。 由此可见，PLGAHAp-ColⅠ双相支架具备修复和重建骨软骨缺损的特性，接种基因修饰的BMSCs 后修复效果更佳。