盐酸普萘洛尔对十二指肠溃疡模型大鼠的作用及其机制的实验研究

舒俊伟，牛智平，杜嘉原(安康市人民医院普外科, 陕西安康 725000)

十二指肠溃疡(duodenal ulcer, DU)是一种消化系统多发病，其病程较长且易反复发作，严重影响患者日常生活。现代医学认为，DU 是侵袭力(包括胃酸分泌过多和氧化压力过高)高于防御力时导致十二指肠黏膜受损形成的溃疡[1-2]。目前DU 治疗方法主要有非手术治疗和外科手术治疗两种，但由于对DU 的病因、发病机制缺乏认知，在临床实践中常存在治疗效果不佳等问题。早期已有研究指出维拉帕米(Verapamil, VR)对半胱胺诱导的DU 大鼠具有保护作用[3]，VR 和盐酸普萘洛尔均可在临床上用于心律失常和心绞痛等疾病的治疗。但是关于盐酸普萘洛尔在DU 中应用的报道鲜有。盐酸普萘洛尔是非选择性β-肾上腺素能受体的抑制剂，其具有阻断血管生成过程和诱导微血管内皮细胞凋亡等作用[4-5]。本研究选取经典的半胱胺致DU 大鼠模型，探究盐酸普萘洛尔对DU 大鼠十二指肠黏膜的保护作用及其对抗氧化酶和IGF-1/PTEN/Akt信号通路的影响，以期为临床诊疗提供新思路，现具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD 大鼠35 只，SPF 级，雌雄各半，体质量为210±10 g，均购于西安交通大学医学院实验动物中心。大鼠适应7 天后开始实验。饲养房湿度控制在50%～70%，温度控制在20 ～25℃，噪音控制在60 dB 以下。饲料为60℃灭菌后的全营养饲料，12 h 明暗交替循环照明。

1.2 仪器与试剂 显微镜购于尼康仪器(上海)有限公司，盐酸普萘洛尔片购于山东健康药业有限公司，半胱胺购自德国Merck 公司。丙二醛(malonaldehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors -1,IGF-1)、PTEN 基 因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten, PTEN) 和α-tubulin 一抗及相应的二抗均购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)。

1.3 方法 实验分组与建模：大鼠随机分为5 组，每组7 只，分别为对照组、十二指肠溃疡模型组(模型组)、低剂量组(模型组+1 mg/kg 盐酸普萘洛尔)、中剂量组(模型组+3 mg/kg 盐酸普萘洛尔)和高剂量组(模型组+9 mg/kg 盐酸普萘洛尔)，其中对照组大鼠灌胃给予1 ml/kg 生理盐水，模型组大鼠灌胃给予450 mg/kg 半胱胺，低、中和高剂量盐酸普萘洛尔组大鼠先用相应浓度的盐酸普萘洛尔预处理，再灌胃给予450 mg/kg 半胱胺[6]。24 h 后用脱颈法处死实验大鼠，剖腹取出十二指肠，观察其损伤情况并且对其进行检测分析。

Western Blot 检测：分别取各组大鼠约0.1 g 的组织并置于研钵中，加入液氮快速充分研磨，再加入裂解液，用蛋白定量试剂盒定量测定蛋白浓度。取50～100 μg 总蛋白，与上样缓冲液混合均匀 (×5)，在沸水浴中加热5 min，使蛋白充分变性后上样。采用聚丙烯酰胺凝胶（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）电泳(分离胶120V和浓缩胶80V)，转膜2 h。用TBST 配制含5 g/dl脱脂奶粉封闭缓冲液后加入一抗，4℃过夜。TBST漂洗液洗膜3 次15 min，加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)标记的二抗，37℃振荡孵育60 min。室温下将膜置于ECL 发光液中振荡孵育3 min，最后应用Image Pro Plus (IPP)软件分析扫描图像目的条带的灰度。

大鼠的十二指肠黏膜损伤程度的评价：对5 组大鼠的十二指肠黏膜损伤程度采用改良的moraes方法进行评价，具体是：0 分表示十二指肠黏膜正常；1 分表示黏膜出现充血、水肿；2 分表示黏膜出现糜烂、出血；3 分表示黏膜损伤发展为浅溃疡；4 分表示黏膜损伤发展为深溃疡；5 分表示黏膜出现溃疡穿孔。

组织病理学评价：将动脉组织挑入包埋剂中，置于烤箱中40℃过夜。次日升温至60℃，48 h 后取出，然后将动脉蜡块切成5 μm 的薄片，用二甲苯进行脱蜡处理共2 次，再依次使用75%，80%，85%，90%，95%，100%的乙醇进行梯度脱水共2次，3 min/次。蒸馏水漂洗后用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin, HE），蒸馏水漂洗后依次用100%，90%，80%的乙醇梯度脱水 2 min，二甲苯透明处理10 min 后用中性树胶来封固，染色成功后在光镜下观察切片的组织形态。

大鼠的抗氧化酶系的测定方法：取十二指肠组织0.5 g，加入生理盐水12 000 r/min 离心15 min后取上清液并保存在-80℃备用。SOD，MDA 和GSH-Px 的检测严格参照相应说明书操作。

1.4 统计学分析 运用SPSS 11.5 统计学软件。对于符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，并进行单因素方差分析(ANOVA)F 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠十二指肠中Akt，IGF-1 和PTEN 的蛋白相对表达量 见图1。采用Western Blot 方法检测各分组大鼠十二指肠中IGF-1/PTEN/Akt 信号通路相关蛋白的表达水平。与对照组相比，模型组Akt，PTEN 和IGF-1 的蛋白相对表达量显著降低。与模型组相比，不同剂量盐酸普萘洛尔组Akt，PTEN 和IGF-1 的蛋白相对表达量显著升高，其差异具有统计学意义 (F=10.319, P ＜0.01)。

图1 各组大鼠十二指肠中Akt,IGF-1 和PTEN 的蛋白相对表达量

2.2 各组大鼠十二指肠黏膜损伤程度的比较 模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组大鼠肠黏膜损伤程度(±s，分)依次为4.06±2.18，2.08±1.67，1.79±1.25，1.50±1.03 和0。模型组大鼠的肠黏膜损伤程度显著高于对照组，其差异具有统计学意义 (P ＜0.05)。低、中和高剂量盐酸普萘洛尔组大鼠的十二指肠黏膜损伤程度依次降低且均显著低于模型组，其差异具有统计学意义(F=3.703, P ＜0.05)。

2.3 各组大鼠的HE 染色结果 见图2。模型组大鼠十二指肠黏膜及黏膜下层完全破坏，随着盐酸普萘洛尔浓度的升高，大鼠的十二指肠黏膜损伤程度逐渐降低。

图2 各组大鼠的HE 染色结果

2.4 各组大鼠十二指肠的SOD，GSH-Px 和MDA比较 见表1。低、中和高剂量盐酸普萘洛尔组大鼠的SOD 均高于模型组，高剂量组与模型组的差异具有统计学意义(F=58.843，P=0.000)。低、中和高剂量盐酸普萘洛尔组大鼠的GSH-Px 水平均高于模型组，高剂量组与模型组的差异具有统计学意义(F=8.026，P=0.001)。低、中和高剂量盐酸普萘洛尔组大鼠的MDA 水平均低于模型组，其差异无统计学意义(F=14.519，P=0.479)。

表1 各组大鼠十二指肠的SOD、GSH-Px 和MDA 的比较

3 讨论

DU 是消化系统的常见疾病，与胃酸分泌异常、幽门螺杆菌(H.pylori)感染[7]、非甾体抗炎药、生活及饮食不规律、工作及外界压力、吸烟以及精神心理因素密切相关。近年来DU 的发病率呈逐渐攀升趋势，严重影响患者的身体健康和生活质量。目前如何有效控制溃疡的发展、减轻溃疡的程度仍是DU 临床和基础研究的壁垒。

本研究采用半胱胺建立DU 大鼠模型，主要是由于半胱胺所致的溃疡存在部位选择性，一般情况下位于十二指肠近端，这种形态学上的变化与人类的DU 类似[8]。因此基于此可作为药物药效和作用机制评价的有效基础。

IGF-1 是由70 个氨基酸组成的单肽，其在细胞增殖、凋亡以及肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用[9-10]。NGUYEN 等[11]人发现IGF-1 可通过激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）加强溃疡组织表皮细胞的再生作用。PTEN 是第一个具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性的抑癌基因，其具有促进细胞凋亡、参与调控细胞周期、抑制血管生成和细胞黏附等作用[12-13]。本研究结果显示与模型组比较，不同剂量盐酸普萘洛尔组Akt，PTEN 和IGF-1 的蛋白相对表达量显著升高。

本研究比较各组大鼠十二指肠黏膜损伤程度结果说明模型组的黏膜损伤程度显著高于对照组，这就说明建模是成功且可用的。低、中和高剂量盐酸普萘洛尔组的十二指肠黏膜损伤程度显著低于模型组，说明盐酸普萘洛尔可有效降低十二指肠黏膜的损伤程度，另外随着剂量的增加，黏膜损伤程度呈减轻趋势，另外HE 染色再次验证了这一结论。

活性氧（reactive oxygen species, ROS）会对蛋白质、核酸、多糖等生物大分子产生损伤作用。当ROS 对细胞产生氧化损伤时，细胞内固有的一套抗氧化防御体系将被激活。常见的抗氧化酶有MDA，谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等，MDA 作为脂质过氧化损伤的重要标志，其可影响膜结构和功能。GSH-Px 可催化GSH 变为氧化型GSH，使有毒的过氧化物还原成为无毒的羟基化合物，同时促进过氧化氢的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的损害[14-15]。十二指肠抗氧化酶系比较结果显示低、中和高剂量盐酸普萘洛尔组大鼠的SOD 和GSH-Px 水平显著升高，MDA水平降低，这就可以说明盐酸普萘洛尔对半胱胺致DU 大鼠具有保护作用并且与抗氧化有关。

综上所述，盐酸普萘洛尔可降低半胱胺致DU大鼠十二指肠黏膜的损伤程度，并且随着剂量的增加，黏膜损伤程度逐渐减轻。盐酸普萘洛尔通过IGF-1/PTEN/Akt 信号通路对DU 大鼠发挥保护作用，并且其作用可能与抗氧化有关。