新型冠状病毒肺炎（COVID-19）热灭活咽拭子及热灭活后提取核酸样本在4℃保存的稳定性研究

喻 晶，吴夏枫，刘晓翌，纪 玲（北京大学深圳医院检验科，广东深圳 518029）

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）自从2019年12月首次在湖北武汉发现以来，短时间内在武汉暴发流行并蔓延至全国，严重危害人民的生命健康，影响人们的生活方式，此病毒对人的传染性强，目前尚无特效治疗，最有效的方式是早发现、早隔离，早治疗、尽早阻断传染源[1]。新冠病毒核酸检测可以为新型冠状病毒肺炎的早期诊断提供直接的实验室证据，也是目前最新诊疗方案（试行第八版）中COVID-19 的确诊依据[2]。由于此病毒传染性极强，使实验室检测人员处于极大的感染风险中，根据第五版新型冠状病毒肺炎防控方案[3]，该病毒对热敏感，56℃ 30 min 可有效灭活病毒，本实验室在核酸检测前会对样本进行56℃ 30min 热灭活处理。目前对热灭活后的新冠样本和提取核酸在4℃保存的稳定性，其对检测结果的影响尚未见报道，样本保存是保证检验质量的重要环节，直接影响检测的结果，本研究把热灭活后的样本及提取的核酸保存在4℃，分别于24, 48, 72 和96h 再次检测样本及提取核酸中SARS-CoV-2 核酸的含量（Ct 值），分析热灭活后样本和核酸在4℃保存的稳定性，为样本的合理保存提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2020年2月5日在本院发热门诊就诊的1 例SARS-CoV-2 核酸检测阳性患者的咽拭子样本，样本保存在Hanks 液（广州邦硕生物技术有限公司）。该患者为武汉人，发热、咳嗽、肺部CT 表现为病毒性肺炎，最终诊断为新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。

1.2 仪器与试剂 全自动核酸提取仪（Stream SP96，中山大学达安基因股份有限公司），荧光定量PCR 扩增仪（ABI 7500, 美国Thermofisher）。恒温水浴箱（ED-19，德国JULABO），核酸提取试剂盒及新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒均为中山大学达安基因股份有限公司产品。咽拭子采样管和保存液为广州邦硕生物技术有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取：COVID-19 患者咽拭子样本先采用56℃水浴30min 灭活病毒，振荡混匀后取200μl样本加入核酸提取试剂板，按照说明书要求提取样本的核酸，然后进行检测。将原始咽拭子样本和提取的核酸保存在4℃冰箱，保存24, 48, 72 和96h 后再次对其进行SARS-CoV-2 核酸ORF1ab 和N 基因检测。

1.3.2 基因扩增：采用RT-PCR 荧光定量PCR 技术，检测新型冠状病毒ORF1ab 基因 和N 基因，每管为25μl 反应体系，其中PCR 反应液体系20μl，样本核酸或阴阳对照品5μl，混匀后，按下面程序在荧光PCR 扩增仪中扩增：50℃ 15 min，95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 45 s，共45 个循环，荧光收集在55℃ 45 s。每次扩增时设置空白和阴阳性对照。以循环阈值（cycle threshold，Ct 值）来进行核酸检测差异的比较。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，采用t 检验比较两组数据的差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 咽拭子样本4℃保存的稳定性分析 咽拭子样本检测结果为ORF1ab 和N 基因双阳性，Ct 值分别为31.27 和30.64，咽拭子样本4℃保存24, 48, 72和 96h 后再次检测ORF1ab 和N 基因，结果见表1。4℃保存24h，咽拭子检测结果与原始结果差异不大，ORF1ab 和N 基因的ΔCt 分别为0.14 和0.04（偏倚均小于1%），但是4℃保存48, 72 和96h后，ORF1ab 和N 基因的ΔCt 明显增大，4℃保存48～72h， ORF1ab 基因核酸降解了大概7 倍，N 基因降解了大概11 倍，4℃保存96h, ORF1ab 和N 基因核酸分别降解了30.91 倍和666.29 倍。

表1 咽拭子样本4℃保存不同时间的检测结果

2.2 核酸样本4℃保存的稳定性分析 核酸样本检测结果为ORF1ab 和N 基因双阳性，Ct 值分别为31.27 和30.64，提取的核酸样本4℃保存24, 48,72 和96h 后再次检测ORF1ab 和N 基因，结果见表2。核酸4℃保存24, 48, 72h 和96h 后，其检测结果与原始结果Ct 值差异不大（均在±1 以内,偏倚均小于3%），表明核酸4℃保存24～96h 后,无明显降解。

表2 提取的核酸4℃保存不同时间的检测结果

2.3 咽拭子样本和提取核酸4℃保存不同时间结果比对 采用t 检验比较咽拭子和核酸4℃保存0，24，48, 72 和96h 后，ORF1ab 和N 基因检测 的结果，均具有显著性差异（tORF1ab=2.023,P=0.039;tN=2.239,P=0.028）。核酸4℃保存24～96h 的稳定性更好。

3 讨论

新型冠状病毒为单链RNA 病毒，是一种新型β 属冠状病毒，基因特征与SARS-CoV 和MERSCoV 有明显区别[2]，其传染性强，人群普遍易感，自2019年12月在武汉发现以来，COVID-19 的病例数快速上升，引起了世界范围的关注,给全球带来巨大挑战[4]。SARS-CoV-2 核酸检测可以为COIVID-19 的诊断提供确诊依据[2]，但是由此病毒在检测过程中对人体的致病力和危害程度尚未明确，使检测人员处于极大的感染风险中。根据最新的专家共识[5]，SARS-CoV-2 对热敏感，56℃ 30 min可有效灭活病毒，实验室在检测前对病人样本进行热灭活处理，降低检测中的感染风险。目前对热灭活后的样本和提取的核酸样本在4℃保存的稳定性尚未见报道，本研究主要分析热灭活后样本和提取核酸在4℃保存24～96h 后的稳定性，为制定合理的样本保存温度和时间提供实验室依据。

本研究发现保存在hanks 液中的咽拭子样本，在4℃保存24h,其核酸无明显降解，但是在4℃保存48～72h 后，其核酸出现明显降解，其中N 基因降解比ORF 1ab 基因降解更明显（11～12 倍vs7-8倍），样本4℃保存96h 后，核酸降解更加明显，其中ORF 1ab 基因降解30 倍，N 基因降解666 倍，其Ct 值为40.02，处于检测的临界值。有趣的是，我们发现提取的核酸样本4℃保存24～96h 后，核酸无明显降解，其ΔCt 均在±1 以内，偏倚均小于3%。核酸4℃保存的稳定性明显比咽拭子样本好，差异具有统计学意义（P＜0.05）。我们把核酸样本在4℃保存2 周，再次检测发现核酸仍然无明显降解（结果未显示），SARS-CoV-2 的RNA 为什么会这么稳定？这个问题值得我们进一步探讨。有研究表明[6]，COVID-19 非常稳定，可在气溶胶中和物体表面上保持稳定数小时至数天的时间。

本研究的局限性在于：①受阳性样本例数的限制，本研究的阳性样本的例数太少，最好对处于高中低不同Ct 值范围的阳性样本进行验证。②未对保存在不用类型保存液中的咽拭子阳性样本进行验证，不同类型的保存液是否存在差异？③本研究只采用了一家公司的试剂，本文的结果是否适合于其他公司的试剂，有待进一步验证。