广西贵港地区人群MN血型等位基因多态性的调查研究

徐庆萍，王 杰，岑松光，赵卫新，陆 永，黄冬梅，梁延连

(1.贵港市平南县人民医院检验科，广西平南 537300； 2.大连医科大学检验医学系，辽宁大连 116027；3.深圳市血液中心输血医学研究所，广东深圳 518035）

人类MNS 血型系统已被证明了共有46 种抗原,MNS 血型基因结构调控的相关抗原严重干扰血型鉴定、临床输血与新生儿同种免疫性疾病；同时在器官移植、法医学鉴定等方面均有着重要的应用价值[1-2]。在亚洲、欧洲、美洲和澳大利亚均有报道由MNS 血型抗体引起的临床输血反应，胎儿和新生儿溶血病，在所报道的病例中至少有 40% 的病例报告了严重的病情。事实证明，由MNS 血型基因变异所表达的糖蛋白（抗原）在临床输血与免疫性疾病中具有重大意义。MNS 血型系统的抗体复杂多样，对应的临床有意义的抗体包括：抗-M，抗-N，抗-S，抗-s，抗-“Mia”，抗-Vw，抗-MUT，抗-Hil，抗-TSEN，抗-‘Mi’等。因 此, 研 究MNS 血型等位基因多态性已成为迫切的问题。MN血型抗原的多态性是由编码血型糖蛋白A(glycoprotein A，GPA)的相关基因GYPA 的第2外显子决定的，在遗传过程中发生的碱基突变、交换、错排、缺失等都会影响MN 抗原的数量或型别的差异。本实验通过随机选择广西贵港地区人群的300 例全血，以血清学与分子生物学手段来分析本地区人群的MN 血型等位基因的多态性，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 研究对象 随机选取广西贵港地区300 例无血缘关系的抗凝血,其中男性109 例，女性191 例，采集静脉血5ml 并用EDTA-K2抗凝。4℃保存，后进行MN 血型鉴定及提取全血DNA。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂：单克隆鼠IgM 性质血清Anit-M(批号：20190709)，Anit-N(批号：20190428)均由上海血液生物科技有限责任公司提供；ID-Card（批号：50531.44.21）由BIO-RAD 提供；Gentra DNA 提取试剂盒（批号：106412）由Promega 公司提供。

1.2.2 仪器：Eppendorf9700 PCR 扩增仪与PrismTMABl3730XL 基因测序仪，Embitec 电泳仪及D77WWL-20-M 凝胶成像仪。Diamed-ID 12SI 卡式离心机；Diamed-ID 37SI 孵育器。

1.3 方法

1.3.1 MN 血型血清学剂量效应检测方法：定量血清与定量红细胞悬液检测M 抗原与N 抗原的凝集强度，以判断MN 抗原在不同个体间的剂量效应，取5μl 红细胞压积加入500μl 生理盐水稀释成5%的红细胞悬液，吸取50μl 稀释5%（v/v）的红细胞悬液加入ID-Card 微板中，分别加入抗-M 或抗-N血清，放入Diamed-ID 12SI 卡式离心机中以1 030r/min 离心10min 后判读结果，根据凝集强度判定MN 抗原在不同个体间的表达。

1.3.2 基因频率计算方法：以m 代表M 基因频率，n 代表N 基因频率，根据基因频率的计算公式：m=M+MN/2，n=N+MN/2计算得到M,N的基因频率。

1.3.3 DNA 提取与PCR 扩增体系：使用Gentra试剂盒提取300 例广西贵港地区人群血样的DNA，并控制DNA的浓度在100ng/μl 左右，以利于后续PCR 扩增。参照深圳市血液中心梁延连[3]设计的引物与扩增条件对贵港地区人群的MN 血型相关基因GYPA 第2 外显子进行扩增，以直接测序碱基序列的多态性来验证MN 血型的型别，PCR 扩增引物的正向引物序列为：5’-CCACATAGCAATTCTCTAAAC-3’；反向引物序列为：5’-GCATTTCTCAGTGTTTGTCAC-3’。

1.3.4 PCR 扩增体系与条件：PCR 采用50μl 体系：10×Buffer：5μl；MgCl2：3μl，dNTP 4μl；正，反向引物各2μl；TaqDNA 聚合酶：1μl；DNA 模板：2μl；ddH2O：31μl。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃×1 min，56℃×1 min， 72℃×1 min，30 个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.5 扩增产物验证： 取3μl 扩增产物经2g/dl 琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段与产物的纯度。

1.3.6 扩增产物纯化与测序：使用离心过滤柱法(Milliprore 公司)纯化扩增产物，以纯化后的扩增产物作为测序反应模板，再一次进行扩增，测序引物与第一次扩增引物序列相一致，采用 10μl 反应体系：引物(终浓度为0.0625pmol/L)：3μl；模板DNA：1μl；ddH2O：2.0 μl；ABI Big-Dyev3.1测序反应液4 μl。PCR 扩增条件：94 ℃预变性10min；94 ℃变 性10s，50 ℃退 火5s，60 ℃延 伸4min，运行25 个循环后产物于4℃保存。对以上扩增产物用醋酸钠/乙醇沉淀法提纯后使用PrismTMABl3730XL 基因测序仪检测，并使用Oli6instatler分析软件进行分析。

2 结果

2.1 广西贵港地区人群的MN 血型抗原剂量效应 通过红细胞与抗体血清定量试验，发现广西贵港地区人群的MN 血型抗原在不同个体间存在明显的剂量效应，即MM 型的红细胞结合抗-M 抗体的凝集强度达到3+以上，MM 型不同个体间的凝集强度在3+～4+之间；NN 型的红细胞结合抗-N 抗体的凝集强度也达到3+以上，NN 型不同个体间的凝集强度在2+～4+之间；而MM 型红细胞结合抗-M 抗体比MN 型红细胞结合抗-M 抗体的凝集强度要高出2+，同样的NN 型红细胞结合抗-N 抗体比MN型红细胞结合抗-N 抗体也高出2+的凝集强度，说明广西贵港人群不同个体间的MN 抗原存在明显的表达差异，这与文献报道的相一致[4]。

2.2 广西贵港地区人群MN 血型基因频率调查结果 见表1。通过MN 血型鉴定，得到本地区的MN 血型基因频率，与已报道的中国新疆哈萨克族人群基因频率接近[6]，与西安地区人群[5]、贵州地区布依族人群[7]、广东省河源地区人群[8]、深圳地区人群[9]等的MN 表型及基因频率对比，差异均有统计学意义。

表1 广西贵港地区人群MN 血型基因分布与其他地区人群的比较

2.3 基因测序结果 见表2。经PCR 扩增后，对300 例广西贵港地区人群血样进行单特异性碱基序列分析，MN 血型基因特异性关键位点在GYPA 基因的第2 外显子1 号位、22 号位、34，35 号位的碱基区别。

表2 广西贵港地区人群MN 血型GYPA 基因的第2 外显子位点区别

从测序结果可清晰的区分MN 杂合子、MM 纯合子、NN 纯合子血型，基因测序分型与血清学结果完全一致，MN 血型特异性鉴定在GYPA 基因第2 外显子上的碱基缩略图见图1。

图1MM，MN，NN 基因型测序代表图（a. MM 纯合子表型；b. MN 杂合子表型；c. NN 纯合子表型）

通过基因测序GYPA 第2 外显子的碱基序列，发现所选的广西贵港地区人群均在第22，34/35位点上区分出MN 血型的特异性，准确地鉴定了MM，MN，NN 基因型，基因分型与血清学检测结果完全相符。

3 讨论

由 GPA 糖蛋白决定的MN 血型系统抗原具有免疫原性，在异型输血与妊娠后可以产生异源免疫IgG 抗体，引起临床输血反应与人类免疫性疾病。MN血型分布具有明显的地区与人类种族间的差异，在分子水平上，已有研究确定了 GPA 的结构和分子遗传基础，同时证明MNS 血型基因家族具有明显的多样性模式[10-13]。MNS 血型的高度多态性，主要由高度同源的GYPA，GYPB 和GYPE 基因之间的重组以及单核苷酸变化产生的多态抗原组成,不同地区人群GYPA 基因单核苷酸的变异会构成该区域人群的种族MN 血型基因多态性特征[14]。

决定MN 血型抗原的相关基因GYPA 由7 个外显子组成，红细胞膜中成熟的 GPA 仅由GYPA基因外显子2 ～7 编码，每个红细胞中大约表达 2.5×105个GPA 糖 蛋 白[15-17]。区分M，N 抗原的血型糖蛋白在GPA 的第1 位和第5 位氨基酸(M:Ser1/Gly5，N:Leu/Glu5)，两个氨基酸均位于GYPA 基因的第2 外显子区间[18]。遗传过程中GYPA 基因与GYPB 基因同源区域的交叉或转换会产生不同的混合型糖蛋白基因，这些基因编码的糖蛋白表现为不同的MNS 变异表型[19]。广西贵港地区人群的调查研究采用了血型血清学与碱基测序的方法分析了GYPA 的第2 外显子，并根据GYPA 的第2 外显子的碱基序列区分出MN 型杂合子，MM型纯合子与NN 型纯合子。根据贵港地区人群MN血型抗原的定量检测发现：M 与N 抗原在不同个体中具有明显的剂量效应，同时发现了广西贵港地区M 基因频率明显偏高，N 基因频率相对较低的分布特征，这与中国新疆哈萨克族人群的MN 血型基因频率接近[6]，与西安地区人群、贵州地区的布依族人群、广东河源地区人群、广东深圳地区人群的MN 型基因频率均有差异[5,7-9]。这说明：MN 血型存在地区的多态性特征，如果广西贵港地区的患者血浆中存在抗-M 不规则抗体时，较难筛检到M 抗原阴性的血液，因为NN 型纯合子的频率只有13%，这将给临床输血带来一定的困扰，以上结论是本研究的应用价值及推广性。随机选择广西贵港地区的300 例人群从基因测序结果证实了GYPA 基因第2 外显子碱基序列的鉴定结果与抗-M，抗-N抗体血清检测分型一致，而且未发现GYPA 的第2外显子中存在特异性突变，其他外显子的碱基是否有异常表达有待进一步的研究。

综上，通过对广西贵港地区人群MN 血型基因频率的调查分析和GYPA 第2 外显子结构特征的了解，明确了广西贵港地区人群的MN 基因多态性，为临床输血前MN 同型输血的储备用血做好铺垫，为广西贵港地区的器官移植、新生儿免疫性溶血性疾病的诊断、法医学鉴定以及群体遗传关系和种族迁移等领域的研究奠定了基础。基于MN 血型的地域性特征比较明显，可能还有相关基因的碱基突变未被发现，有待增加标本量对广西贵港地区人群的MN 血型进行深入与更广泛的研究。