三仁汤对脾胃湿热证型胃癌癌前病变模型大鼠的作用机理

邹先明 吴莹 吴欢

摘要：目的 探究三仁湯对脾胃湿热证型胃癌癌前病变模型大鼠关性的作用机理。方法 将50只健康清洁级SD大鼠视为研究对象，经数字随机法分为随机分为正常组、模型组、高剂量三仁汤组、中剂量三仁汤组和低剂量三仁汤组，总共5组，每组各10只，利用复合因素复制脾胃湿热证癌前病变模型大鼠。采用免疫组织化学检测法检测P53、Bcl-2;采用原位末端标记法检测细胞凋亡指数（AI）;采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素10（IL-10）和环氧化酶2（COX-2），并进行组间比较和分析。结果 在P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平方面，模型组要明显高于正常对照组（P<0.05）;三仁汤（高、中、低剂量）组均明显低于模型组（P<0.05），以中剂量组降低效果最为明显。在血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平方面，模型组要明显高于正常对照组（P<0.05），三仁汤（高、中、低剂量）组均低于模型组（P<0.05），以中剂量组降低效果最为明显。结论 三仁汤对脾胃湿热证型胃癌癌前病变模型大鼠关性的作用机理能表现为下调脾胃湿热模型大鼠胃黏膜P53、P21ras、Bcl-2、AI、COX-2蛋白水平的，抑制血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10过度反应。

关键词：三仁汤;脾胃湿热证;胃癌癌前病变;炎性因子;细胞凋亡

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）11-0063-04

【Abstract】Objective： To explore the mechanism of Sanren Decoction on gastric precancerous lesions in rats with spleen-stomach damp-heat syndrome. Methods： 50 healthy and clean SD rats were regarded as the research objects and were randomly divided into normal group， model group， high-dose， medium-dose and low-dose Sanren Decoction groups. 5 groups in total， 10 rats each group. The model rats were made by using compound factors to replicate precancerous lesion with spleen-stomach damp-heat syndrome. The immunohistochemical detection method was used to detect P53 and Bcl-2 and the in situ end labeling method to detect cell apoptosis index （AI）， enzyme-linked immunosorbent method （ELISA） to detect interleukin 1β （IL-1β）， leukocyte mediator Interleukin 6 （IL-6）， Interleukin 8 （IL-8）， Interleukin 10 （IL-10） and Cyclooxygenase 2 （COX-2）. The comparison and analysis were made among the groups. Results： In terms of levels of P53， Bcl-2， P21ras， AI， and COX-2， the model group was significantly higher than the normal control group （P<0.05） and Sanrentang groups （high， medium， and low dose） were significantly lower than the model group （P<0.05）. The medium-dose group had the most obvious reduction effect. In terms of serum IL-1β， IL-6， IL-8 and IL-10 levels， the model group was significantly higher than the normal control group （P<0.05） and the Sanrentang groups （high， medium， and low dose） were all lower than the model group （P<0.05）. The medium-dose group had the most obvious reduction effect. Conclusion： The mechanism of action of Sanren Decoction on gastric precancerous lesions in model rats with spleen-stomach damp-heat syndrome can be represented by down-regulating the gastric mucosal P53， P21ras， Bcl-2， AI， COX-2 protein levels in the model rats with the spleen and stomach damp-heat syndrome and inhibiting the overreaction of serum IL-1β， IL-6， IL-8 and IL-10.

【Key words】Sanren Decoction， spleen-stomach damp-heat syndrome， gastric precancerous lesions， inflammatory factors， cell apoptosis

胃癌是临床最为常见的恶性肿瘤之一，好发于各个年龄段群体中，多以40岁以后群体为主，男性发病无明显差异，具有较高的致死率，会严重威胁患者的生命安全。目前，临床对于胃癌的治疗并无特效手段，无论是手术治疗，还是放化疗，5年生存率均比较低[1]。研究显示[2]，胃癌前病变的早期阶段多见脾胃湿热证。脾胃湿热证与胃癌前病变的发病机制均与炎症病变及细胞增殖与凋亡的失衡密切相关，炎症可以改变癌基因和抑制癌基因的表达和转化，促进细胞向恶化发展，炎症因子能活化大多数细胞的生存信号，从本质上促成肿瘤的形成[3]。对胃黏膜癌前病变的临床防治，目前西医尚缺乏理想药物和治疗手段，中医药在此方面有独特作用和明显优势。三仁汤是中医学疾病治疗的一种重要中药方剂，其主要功能为清利湿热，在治疗湿热初起方面有很强的功效。为此，本实验探讨三仁汤对脾胃湿热证型胃癌癌前病变模型大鼠性作用机理，旨在为临床提供一定的理论参考。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 一般材料 实验动物：健康清洁级SD大鼠50只，均购自南方医科大学实验动物中心，合格证号（SCXK（粤）2006-0015），体质量180～220 g，平均体质量（200.23±11.07）g。通过数字随机表法分组，每组各10只。

三仁汤出药方构成：杏仁15 g，制半夏15 g，薏苡仁18 g，飞滑石18 g，白通草6 g，白蔻仁（后下）6 g，竹叶6 g，厚朴各6 g。上述各药物先用清水浸泡30 min，然后根据药量：水量为1：8的原则煎煮3次，3次药汁混合，离心取澄清药汁。随后进行药物配制，三种浓度分别为0.41，0.82，1.64 g/mL，保存待用。

高糖高脂饲料：将12%猪油、8%蜂蜜与普通饲料融合加工（南方医科大学实验动物中心提供）。浓度为109/mL的大肠埃希杆菌液（细菌编号：44113-10，ATEC25992，中国微生物研究所提供）。

仪器设备：Avanti TM230 型 超 速 冷 冻 离 心 机（美 国BECKMAN 公司）;PL303 型电子天平（梅特勒托利多仪器<上海>有限公司）;SN-695 型放射免疫 r 计数测量系统（上海核辅光电仪器有限公司）;南方医科大学公共卫生热带学院仿真模拟气候仓（可以调节温度、湿度、风速等）。

1.2 造模方法 正常对照组：采用普通饲料喂养，温度和相对湿度分别控制为20～28 ℃、50%～60%的。

脾胃湿热证大鼠模型组：采取“湿热环境+高脂高糖饮食+白酒”法先建立脾胃湿热证模型，再在此基础上每日自由饮用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）溶液+饥饱失常的综合方法，造成胃黏膜上皮的中、重度不典型增生及不完全性肠化生，建立脾胃湿热胃癌前病变大鼠模型。

三仁汤组：低剂量0.41 g/mL，中剂量0.82 g/mL，高剂量1.62/mL。在脾胃湿热证大鼠模型的基础上，移出置于自然环境12 h后开始灌服三仁汤煎剂，2 mL/200 g，每日1次，7 d后动物处死做相关检查。

1.3 标本检测 标本采集：大鼠处死前禁食12 h，用10%水合氯醛按0.7 mL/200 mg腹腔注射麻醉，迅速打开腹腔。经腹主动脉采血2 mL注入普通采血管待凝固后，在4℃环境下，放置3000 r/min条件下进行离心，持续10 min，静置15 min后将上层血清分离，-20 ℃保存待检。

采用免疫组织化学方法检测 P53、Bcl-2、P21ras的表达，采用原位末端标记法检测细胞凋亡指数（AI），采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清白细胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素10（IL-10）和环氧化酶2（COX-2）。具体实验步骤按照试剂盒说明书操作。

1.4 统计学分析 搜集、整理2组患者的上述数据，比如手术时间、术中出血量、住院时间等，采用统计学软件（SPSS23.0版）进行统计、分析，对比操作实行χ2检验和 t检验，当P值在 0.05 以下时，提示差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 各组P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平的比较 在P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平方面，模型组要明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;三仁汤（高、中、低剂量）组均明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），以中剂量组降低效果最为明显。如表1所示。

2.2 各组血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10对比 在血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平方面，模型组要明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），三仁汤（高、中、低剂量）组均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），以中剂量组降低效果最为明显。详情见表2。

3 讨论

流行病学调查显示，脾胃湿热证多涉及消化系统，在消化系统疾病中较为常见，具有反复发作、复杂性高、治愈难度大等特点，其中脾胃湿热证是慢性胃炎中医分型的常见病型[4]。研究认为湿热证可能是慢性胃炎向癌前病变及早期癌过度的病理阶段[5]。有研究表明：脾胃湿热证有癌变倾向[6]。三仁汤是中医方剂经典方，其组成为杏仁、制半夏、薏苡仁、飞滑石、白通草、白蔻仁（后下）、竹叶、厚朴。现代实验研究显示：三仁汤中各单味药物均有不同程度的抑制肿瘤作用，同时临床有运用本方治疗胃癌前病变湿热内蕴证的报道，为本方用治脾胃湿热胃癌前病变提供了一定的药理学及临床基础。

脾胃湿热证的病变中心为脾胃，脾胃的病变又以其功能病变为核心，而胃黏膜上皮细胞增殖和凋亡之间的动态平衡又会对脾胃功能产生关键性的影响，若此种平衡被打破，极有可能引起脾胃功能病变。细胞凋亡是个体发育过程中由一系列基因控制的细胞主动死亡过程，在多数细胞类型中，基因Bcl-2与P53是重要的细胞凋亡调节因子，在细胞凋亡中相互联系，相互作用，从而调控细胞凋亡[7]。本研究结果显示，与正常对照组相比较，模型组P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平均明显下降（P<0.05），表明了造模成功。进一步分析发现，三仁汤（高、中、低剂量）组均明显低于模型组（P<0.05），以中剂量组降低效果最为明显，说明了三仁汤对脾胃湿热证大鼠胃粘膜上皮细胞增殖与凋亡失衡的调节，可能通过下调增殖与凋亡相关P53、Bcl-2及COX-2 基因蛋白的表达实现。脾胃湿热证以脾胃为病变中心，经过长期的临床观察和实验研究表明：中医的脾胃湿热证与胃病、胃黏膜病理改变之间存在着非常密切的关系。研究显示[8]，白细胞介素类是一族重要的细胞因子，其中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等均有一定的促炎性作用，湿热证模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10含量的变化显著，进一步说明湿热证本质与炎症及免疫病理关系密切。最新研究表明[8]：炎症可以改变癌基因和抑制癌基因的表达和转化，以促进细胞向恶性转变。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平均明显下降（P<0.05），说明造模成功。进一步分析发现，三仁汤（高、中、低剂量）组均低于模型组（P<0.05），以中剂量组降低效果最为明显，初步提示三仁汤治疗温病湿热证诸症的机制为调节血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 等炎症因子在机体内的含量，降低炎症反应程度，平衡免疫，提高治愈速度。

综上所述，三仁汤可能通过下调脾胃湿热模型大鼠胃黏膜P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2蛋白水平，纠正脾胃湿热证大鼠胃黏膜上皮细胞增殖与凋亡的失衡，调节血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 等炎症因子在机体内的含量，降低炎症反应程度，从而促进胃黏膜损伤修复。本研究充分秉承三仁汤辛开苦降、燥湿泄热、调达脾胃的组方理念，更深入挖掘经典方的科学内涵，为临床推广运用提供强有力的证据。

参考文献：

[1]吴雨轩，庄丽维.胃癌相关基因的研究进展[J].医学综述，2018，24（5）：63-68.

[2]李秋晨，郑勇，尚国臣，等.胃癌及胃黏膜癌前病变组织SSBP1表达临床意义[J].中华肿瘤防治杂志，2018，25（5）：325-328.

[3]李云鹏，文小敏，武凯歌，等.三仁汤对脾胃湿热证大鼠行为学及下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响[J].南方医科大学学报，2010，12（1）：126-128.

[4]谢晓平，林阿丰，陈晓帆.胃癌前病变中医辨证分型与Hp感染相关性的研究[J].云南中医学院学报，2017，40（4）：60-62.

[5]季旭明，庄凌云，崔有利，等.三仁汤对湿热证型病毒性肺炎小鼠模型的多靶点干预作用[J].中华中醫药学刊，2019，12：213-214.

[6]刘宝珍.慢性萎缩性胃炎中医证型与幽门螺杆菌感染、病理分级的相关性研究[J].现代中西医结合杂志，2018，12（4）：612-614.

[7]鲁香凤，聂里红，毛颖秋，等.慢性胃炎3种证型胃黏膜上皮细胞超微结构观察[J].中华中医药杂志，2016，15（12）：5323-5328.

[8]颜勤.三仁汤对温病湿热证大鼠模型白介素及免疫球蛋白的影响[J].中国中西医结合消化杂志，2017，22（9）：506-509.

（收稿日期：2020-06-22）