脑外伤后血清外泌体miR-451的表达变化及意义*

潘长福,娄远蕾,段景丽,余兆祥,何燕,翁中海

景德镇市第一人民医院 1神经外科， 3急诊科(江西景德镇 333000)；2南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所(江西南昌 330006)

创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)具有很高的发病率，是全球主要的致死、致残性疾病之一[1]。目前其诊断、损伤严重程度及预后评估主要依赖于神经系统检查和神经影像学检查，然而两者皆有一定局限性。外泌体(exosomes)是一种直径40～150 nm的脂质双分子层囊泡，其内包含有各种生物活性物质，如蛋白质、脂质和核酸(包括miRNA)等，并且可以在外周血中稳定存在，目前已知几乎所有类型的细胞均可以分泌外泌体[2-3]。microRNAs(miRNA)是一类内源性单链小分子RNA，在转录后水平调节基因表达，参与调控细胞增殖、分化和凋亡等多种病理生理过程[4]。研究发现，miRNA对多种中枢神经系统疾病诊断具有重要意义，是一种可靠的生物学指标[5-7]。同样，已有研究证实，脑外伤后脑组织、血清内miR-451表达量发生急剧变化[8-10]，具有潜在的生物指标价值[10]，然而脑外伤后血清外泌体miR-451表达变化如何，目前尚鲜见报道。本研究拟检测脑外伤患者伤后血清外泌体miR-451的动态表达变化，探讨其对脑外伤诊断、损伤严重程度及预后评估的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 依据格拉斯哥评分(Glasgow Coma Scale，GCS)，可将TBI分为轻型(GCS 13～15分)、中型(GCS 9～12分)和重型(GCS 3～8分)[11]。本研究选择2018年7月1日至2019年6月30日在景德镇市第一人民神经外科收治的120例脑外伤患者(轻、中、重型各40例)。病例入选标准：(1)明确头部外伤史，伤后有昏迷、记忆缺失或定向力障碍等症状，或经颅脑CT证实有颅脑外伤阳性结果者；(2)年龄18～75岁；(3)受伤后4 h内入院。排除标准：(1)严重心、脑、肝、肾等慢性病史；(2)受伤前有饮酒、使用毒麻及镇静药物；(3)精神、智力异常或存在其他神经系统疾病；(4)妊娠；(5)伤后7 d内死亡或出院。所有患者根据病情变化采取脱水、止血、手术和营养支持等对症治疗。另选取40名健康成年体检者作为对照组。本研究已经医学伦理委员会批准，并取得患者及(或)家属知情同意。

脑外伤组男72例，女48例，年龄(45.4±15.4)岁；对照组男22例，女18例，年龄(43±12.3)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 血清标本收集 入院后所有患者首次采血由急诊科护士在伤后4 h内完成，伤后1 d、3 d 和7 d采血由神经外科住院部护士完成，每次采集静脉血5 mL，健康体检者于空腹时留取静脉血。静脉血先在室温下3 000×g离心30 min，再以16 000×g离心15 min后吸取上层去除细胞的血清，以去RNA酶EP管分装并保存在-80℃冰箱中备用。

1.3 血清外泌体提取及鉴定 采用血清外泌体试剂盒(Thermo Scientific公司)提取血清中的外泌体，提取步骤严格按照试剂盒说明书进行。提取完成后采用电镜鉴定外泌体形态，采用Western blot鉴定外泌体表面蛋白CD63及CD9。

1.4 miR-451检测 采用Trizol试剂盒(Takara公司)提取外泌体总RNA；以PrimeScriptTMRT reagent kit(Takara公司)逆转录RNA为cDNA，反应条件：42℃ 15 min，85℃ 5 s。采用SYBR荧光(Takara公司)real-time PCR技术，按miScript Primer Assays、miScript SYBR Green PCR Kit反应体系，使用ABI 7500 real-time PCR system进行扩增反应。反应条件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环。采用U6作为内参，健康体检者血清为对照，用2-ΔΔCt表示各组血清外泌体miR-451的相对表达量，反应重复操作3次。

1.5 GOS评分 所有脑外伤患者于伤后6个月通过电话回访或门诊随访方式进行格拉斯哥预后(Glasgow Outcome Scale，GOS)评分，并分为预后良好组(GOS 4～5分)和预后不良组(GOS 1～3分)。GOS评分分级：1分为死亡；2分为植物生存，长期昏迷，呈去皮质或去脑强直；3分为重残，需他人照顾；4分为中度残疾，生活能自理；5分为恢复良好，成人仍工作、学习[12]。

2 结果

2.1 脑外伤组的临床资料比较 首次采血(4 h以内)GCS评分3～8分40例(33.3%)，9～12分40例(33.3%)，13～15分40例(33.3%)。预后不良(GOS 1～3分)29例(24.2%)，预后良好(GOS 4～5分)91例(75.8%)。受伤机制汽车/摩托车/电动车76例(63.3%)，摔伤/高处坠落21例(17.5%)，硬物打击11例(9.2%)，其他12例(10.0%)。影像学检查结果：硬膜下血肿64例，蛛网膜下腔出血68例，弥漫性轴索损伤25例，硬膜外血肿41例，脑挫裂伤76例，颅骨骨折69例。

2.2 血清外泌体鉴定 电镜结果表明血清提取物具有明显的外泌体膜状结构，直径约100 nm，见图1-A；Western blot显示血清提取物表达外泌体标记蛋白CD63和CD9，见图1-B。以上结果证实血清提取的沉淀物为外泌体。

2.3 血清外泌体miR-451在脑外伤患者中的诊断价值 real-time PCR结果显示脑外伤(GCS 3～15分)和轻型颅脑损伤(GCS 13～15分)患者伤后4 h内血清外泌体miR-451的表达水平分别为对照组的(3.46±0.32)倍和(2.12±0.21)倍，均明显高于对照组(1.0±0.00)(P<0.01)。采用ROC曲线分析血清外泌体miR-451对脑外伤及轻型颅脑损伤的诊断价值，结果显示两者曲线下面积(AUC)分别为0.917(95%CI0.867～0.968，敏感度0.856，特异度0.900)和0.911(95%CI0.835～0.988，敏感度0.700，特异度1.000)，均具有较高的诊断效能，见图2。

注：A：电镜显示血清提取物具有清晰的外泌体膜状结构，直径约为100 nm；B：Western blot显示随机3个实验样本血清中提取物均表达外泌体特异蛋白CD63和CD9

注：A:脑外伤(GCS 3～15分)；B:轻型颅脑损伤(GCS 13～15分)

2.4 血清外泌体miR-451的表达量与脑外伤损伤严重程度的相关性 real-time PCR检测轻、中、重型脑外伤患者伤后4 h内及1 d、3 d、7 d血清外泌体miR-451的表达量，结果发现：(1)轻型颅脑损伤患者伤后4 h起血清外泌体miR-451表达明显增高，1 d时达高峰，随后逐渐下降，7 d时已恢复至正常水平；(2)中、重型脑外伤患者伤后4 h起血清外泌体miR-451表达明显增高，3 d时达到峰值水平，随后逐渐降低，7 d时仍维持在较高水平；(3)比较轻、中、重型颅脑损伤患者伤后同一时间点血清外泌体miR-451的表述水平，结果具有显著差异性(P<0.05)，呈逐级升高趋势；(4)Spearman相关性分析表明，伤后各时间点血清外泌体miR-451的表达水平与脑损伤严重程度呈正相关(r>0.70，P<0.001)。见表1、2。

表1 脑外伤后不同时间点血清外泌体miR-451表达量

表2 脑外伤后不同时间点血清外泌体miR-451的表达与脑损伤严重程度相关性分析

2.5 血清外泌体miR-451的表达量与脑外伤预后的相关性 依据脑外伤患者GOS评分，将其分为预后良好组(GOS 4～5分)和预后不良组(GOS 1～3分)，比较两组患者伤后4 h内及1 d、3 d和7 d血清外泌体miR-451的表达量。real-time PCR结果显示，伤后同一时间点比较，预后不良组血清外泌体miR-451表达水平均较预后良好组明显增高(P<0.01)；Spearman相关性分析表明，伤后各时间点血清外泌体miR-451的表达量与预后呈明显负相关(r<-0.56，P<0.001)。见表3、4。

表3 脑外伤后不同时间点血清外泌体miR-451表达量

表4 脑外伤后不同时间点血清外泌体miR-451的表达与伤后6个月预后相关性

3 讨论

miRNA为小分子单链RNA，通过结合非编码区mRNA，在转录后水平调节基因表达和蛋白合成[13]。目前已有报道，miR-16、miR-92a、miR-451、miR-20a、miR-93、miR-191和miR-499等多种miRNA在脑外伤患者外周血和(或)脑脊液内表达明显增加，有望成为脑外伤潜在的特异性和敏感性指标[7，10，13-14]。然而，由于外周血内miRNA很容易降解，限制了miRNA的生物指标价值[15]。外泌体是一类具有脂质双层膜结构的囊性小泡，携带着从细胞释放的蛋白质、mRNA和miRNA等物质[3]。目前已知中枢神经系统内几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体[16]。脑外伤后，中枢神经系统细胞分泌外泌体，后者穿透血脑屏障并释放入外周血中[15]。外泌体内miRNA含量丰富，其双层脂质结构可避免miRNA降解[15]，因此检测外周血内外泌体miRNA可能对脑外伤的诊断与预后评估具有重要价值。

目前关于外周血外泌体miRNA对脑外伤的生物学价值研究尚未见报道。因本研究小组前期miRNA芯片检测小鼠脑外伤4 h后脑海马内miRNA表达谱，发现miR-451升高达165.8倍，在所有检测的miRNA变化最为明显[8]，本研究检测脑外伤患者伤后血清外泌体miR-451的动态表达变化，探讨其对脑外伤的诊断、损伤严重程度及预后评估中的意义。目前关于外周血miR-451表达量对脑外伤的生物标志价值研究极少，仅在2016年Bhomia等[10]有所报道。其研究发现，脑外伤患者伤后早期血清中miR-451表达明显升高，其曲线下面积为0.82，对脑外伤的诊断具有中等诊断效能[10]，但该研究样本量较小，且没有对血清内miR-451表达量与脑外伤严重程度及预后进行相关性分析。在本研究中，脑外伤患者早期(4 h内)血清外泌体miR-451表达水平较健康人群已明显升高，其曲线下面积0.917，对脑外伤的诊断，具有较高的诊断效能。与Bhomia等[10]检测血清miR-451比较，本研究结果提示检测血清外泌体miR-451对脑外伤诊断具有更高的诊断效能，可能与外泌体内miRNA性质稳定，不容易降解有关。轻型颅脑损伤患者神经系统症状轻，头颅CT、血清蛋白类分子检查敏感性低，一直是脑外伤诊断中的难点[17]。本研究同样发现轻型颅脑损伤患者外伤后早期血清外泌体miR-451表达量明显增加，其曲线下面积为0.911，具有较高的诊断效能，可能为轻型颅脑损伤患者的早期诊治带来一定帮助。

本研究还检测了轻、中、重型颅脑损伤患者伤后血清外泌体miR-451的动态表达变化，发现轻型颅脑损伤患者血清外泌体miR-451在1 d时达高峰，随后逐渐下降，7 d时恢复正常水平，与轻型颅脑损伤患者的病程较一致。中、重型颅脑损伤患者血清外泌体miR-451则在3 d时达高峰，7 d时仍维持在较高水平，可能有中、重型颅脑损伤病程长，水肿时限延长或二次损伤有关。轻、中、重型颅脑损伤患者伤后同一时间点比较，血清外泌体miR-451表达量逐级升高，并与脑损伤严重程度呈正相关，提示脑外伤后血清外泌体miR-451的表达量越高，脑损伤程度越重。对于脑外伤患者及家属而言，预后情况是其最为关心的问题之一，目前临床工作中，脑外伤预后评估主要依赖于神经系统检查和影像学检查。本研究发现，脑外伤预后良好组(GOS 4～5分)血清外泌体miR-451表达量与预后不良组(GOS 1～3分)比较明显降低，与GOS评分负相关，提示血清外泌体miR-451越高，其预后越差。因此血清外泌体miR-451的检测，可能为脑外伤的预后评估提供了一种新的手段。

脑外伤发病机制非常复查，涉及炎症、细胞凋亡、可塑性改变及神经再生等[7]。miR-451是近年来研究较多的miRNA之一，参与造血系统分化、胚胎发育和神经系统发育等多种病理和生理过程[18]。同样，在中枢神经系统疾病病理生理过程中，miR-451也发挥重要作用。Liu[19]和Li等[20]发现在脑缺血灌注损伤过程中，miR-451可以靶向抑制CELF2，保护神经元，通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制炎症反应；Nan等[21]发现miR-451可以靶向抑制mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路，进而抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭。Alural等[22]发现，miR-451参与神经系统发育过程；Sun等[23]则发现miR-451可以通过靶向抑制TLR4，从而抑制小胶质细胞活化介导的神经炎症反应。本研究小组和Meissner等发现脑外伤早期海马及皮质内miR-451表达急剧升高[8-9]。在本研究中，脑外伤后血清外泌体miR-451表达量明显增加，其表达量与脑损伤严重程度呈正相关，与GOS预后评分呈负相关。因此可以推测miR-451可能在脑外伤早期的病理生理过程和随后的脑功能恢复过程中发挥重要作用，其具体作用机制值得进一步去研究。

综上所述，本研究显示脑外伤后血清外泌体miR-451表达水平明显增高，其表达水平与脑损伤严重程度及预后相关，可作为脑外伤诊断、损伤严重程度及预后评估的潜在生物指标。相对于神经影像学检查而言，该检测方法简便、快捷，价格低廉，而且没有辐射，具有潜在的临床应用价值。但是，本研究样本量较少，需要进一步扩大样本和多中心进一步明确其参考区间及应用价值。