特异性脱敏法治疗柳树花粉引起的过敏性鼻炎的实验研究∗

罗兆莉 轩 冉 莘琳琳 孙其玉 董晏榕 任其奎 杨 帆 田兆菊

(1.山东第一医科大学/山东省医学科学院 公共卫生学院,泰安 271016)(2.山东第一医科大学/山东省医学科学院 第二附属医院,泰安 271016)

花粉是引起I型超敏反应性疾病的重要致敏原之一,致敏花粉的种类因地区、海拔、季节的不同而有所不同[1]。柳树是我国分布较广的树种,每年产生的花粉已成为春季主要的致敏原之一,常引起人类过敏性鼻炎的发作。目前,临床上多采用口服抗组胺类药物、同时鼻喷激素法治疗过敏性鼻炎,有一定疗效;但患者长期使用会引发神经系统的不良反应,

表现为头晕、头昏、嗜睡、乏力等[2]。特异性脱敏疗法是目前唯一能因病治疗过敏性疾病的方法[3],该方法可预防新出现的过敏原引起的超敏反应,防止过敏性鼻炎进一步发展为哮喘。

目前,我国临床成功应用的第一种特异性脱敏治疗制剂是尘螨滴剂,对其他过敏原引起的过敏性鼻炎的免疫治疗还处于研究阶段。为此,本研究建立了柳树花粉过敏性鼻炎的小鼠模型,采用递增变应原剂量的方法给小鼠注射花粉过敏原,通过比较小鼠鼻部症状、检查鼻黏膜组织形态学以及血清中sIgE的含量变化[4],探索特异性脱敏疗法对过敏性鼻炎的治疗效果,为临床防治过敏性鼻炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级健康昆明小鼠58只,雄雌随机,7周龄,体质量(18±2)g,由山东第一医科大学(山东省医学科学院)实验动物中心提供。植物蛋白提取试剂盒(Cat#BC3720)为北京索莱宝科技有限公司产品;小鼠血清特异性sIgE酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒为上海广锐生物科技有限公司产品;B-500超微量分光光度计为上海元析仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 柳树花粉的采集及形态观察:于2018年3月柳树雄花成熟散粉时,采用自然脱落法收集花粉[5],室温晾干后装于1.5 mL离心管中,在-70℃冰箱中保存[6]。取少量花粉置于光学显微镜下观察。

1.2.2 柳树花粉蛋白质提取液的制备及浓度测定:取100～200 mg的柳树花粉放入液氮中过夜,在液氮中将花粉研碎;加入 10μL的蛋白酶抑制剂、10μL的苯甲基磺酰氟(PMSF)和1 mL的细胞裂解液,4℃裂解20 min,期间每隔 5 min震荡 1次;4℃,14 000 r/m in离心30 m in[7],取上清液[8]用超微量分光光度计进行蛋白定量。

1.2.3 建立柳树花粉引起的过敏性鼻炎小鼠模型[9]:将小鼠随机分成实验组和对照组。实验组分为A、B、C、D四个小组,每组8只小鼠,对照组26只小鼠。将柳树花粉蛋白提取液混悬于含5%氢氧化铝的生理盐水中[10],配成浓度为 1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL和3.0 mg/mL的溶液。腹腔注射0.4 mL/只,对照组注射生理盐水。实验组和对照组均每间隔3 d重复注射1次,共7次;第 7次注射后的第6天开始对小鼠进行滴鼻激发。实验组和对照组小鼠均采用两个浓度滴鼻,分别为10.6 mg/mL和16 mg/mL,10μL/只,每天 1 次,连续6 d。每次激发完成后30 min内,观察小鼠打喷嚏、抓鼻等行为学症状[8]。

1.2.4 脱敏治疗[11]:过敏性鼻炎的小鼠模型成功建立后,每隔5 d皮下注射柳树花粉蛋白进行特异性脱敏治疗。实验组采用柳树花粉蛋白提取液进行注射,起始治疗阶段有两种浓度:0.16 mg/mL和1.6 mg/mL;维持治疗阶段一种浓度:1.6 mg/mL。起始治疗第一阶段每天注射1次,连续3 d,浓度为0.16 mg/mL,剂量依次为0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL;第二阶段每天注射 1次,连续 3 d,浓度为1.6 mg/mL,剂量依次为 0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL。维持治疗阶段从起始治疗阶段后的第7 d开始,每天注射1次,浓度为1.6 mg/mL,剂量为0.5 mL,维持治疗5 d。对照组用生理盐水进行皮下注射,方法、剂量同实验组。每次注射后30 min内观察小鼠的打喷嚏、流鼻涕、抓鼻等症状;取小鼠血液,分离血清,检测血清中特异性sIgE的含量,采用安乐死的方法处死小鼠,取鼻黏膜进行病理学检查。

1.2.5 小鼠鼻部症状的观察及评分[8]:根据小鼠症状,按照以下描述给小鼠计分:①打喷嚏。4个以内1分;4～10个 2分;10个以上 3分。②抓鼻次数。轻度抓鼻(4次以内)1分;频繁抓鼻(4～10次)2分;抓鼻不止(10次以上)3分。以叠加法记分,总分超过5分即为建模成功。

1.2.6 测定血清中特异性sIgE的含量[12]:小鼠尾静脉采血[13],分离血清,用ELISA试剂盒测定血清中特异性sIgE的含量。

1.2.7 鼻黏膜病理学检查[1]:用颈椎脱臼法处死部分小鼠,取双侧鼻腔组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察鼻黏膜局部病理学变化。

1.3 统计方法

所有计量资料采用(±s)表示,采用SPSS 22.0对数据进行统计学分析。所有计数资料差异性采用P＜0.05表示,差异的显著性采用SPSS 22.0软件中非参数检验来检验。

2 结果

2.1 柳树花粉的形态

用显微镜观察柳树花粉的形态,见图1。

图1 柳树花粉(×400)Fig.1 Willow pollen(×400)

2.2 小鼠鼻部症状观察及评分

实验组小鼠可见频繁抓鼻子并伴有打喷嚏症状,有的小鼠30 min内喷嚏数可高达93次。小鼠打喷嚏、抓鼻等鼻部症状,见图2。经行为学评分后,实验组小鼠有25只大于5分,空白组小鼠均小于5分,且具有统计学差异(z=-6.627,P＜0.05,非参数检验),由此可知建模成功。

2.3 小鼠鼻黏膜组织学检查

取小鼠的鼻黏膜制作组织学切片,显微镜下观察,空白组小鼠鼻黏膜中未见炎性细胞。实验组中,用低浓度激发的小鼠,鼻黏膜中可见大量嗜酸性粒细胞浸润,偶见浆细胞;高浓度激发的小鼠鼻黏膜中可见嗜酸性粒细胞,但比低浓度激发组少,比空白组多,说明低浓度的柳树花粉蛋白提取液的激发效果更好,建立的过敏性鼻炎模型更典型。治疗后小鼠鼻黏膜组织学切片中可见嗜酸性粒细胞明显比治疗前减少,并出现浆细胞,说明脱敏治疗有效,见图3。

图2 小鼠激发后症状注:左侧小鼠在滴鼻激发后出现搔鼻现象,同时出现打喷嚏症状(瞳孔缩小)Fig.2 Symptoms of mice after nasal stimulationNote:The mouse on the left side was scratching and sneezing after nasal stimulation(pupil reduction)

图3 各组小鼠鼻黏膜显微镜检查(HE染色,×400)注:A:空白组;B:实验组(低浓度激发);C:实验组(高浓度激发);D:治疗组Fig.3 Microscopic examination of the nasal mucosa of mice in each group(HE staining,×400)Note:A:blank group;B:experimental group(low concentration stimulation);C:experimental group(high concentration stimulation);D:treatment group

2.4 小鼠血清特异性sIgE含量的测定

对小鼠血清中特异性sIgE含量进行检测,实验组小鼠激发后血清特异性sIgE含量有升高的趋势,脱敏治疗后血清中sIgE含量有下降的趋势,但是差异没有统计学意义(P＞0.05),见图4。

图4 实验组小鼠各阶段血清特异性sIgE含量变化Fig.4 Changes of serum specific sIgE levels in the experimental group at various stages

3 讨论

过敏性鼻炎是一种常见病[14],现临床上多采用口服抗组胺类药、同时鼻喷激素进行治疗,有一定疗效,但长期使用会导致不良反应,如过敏症状加重、激发轻型哮喘等。花粉是引起过敏性疾病的主要原因,目前特异性脱敏疗法[15]是唯一能因病治疗过敏性疾病的方法,该方法也可预防发生新过敏原的超敏反应及防止过敏性鼻炎发展为哮喘,但是现在我国临床成功应用的第一种特异性脱敏治疗制剂是尘螨滴剂,只针对尘螨的治疗,对其他过敏原引起的过敏性鼻炎的免疫治疗还处于研究阶段。

鉴于此,本课题采用柳树花粉来建立过敏性鼻炎的小鼠模型,旨在通过脱敏疗法治疗过敏性鼻炎,为临床治疗过敏性鼻炎提供一定的依据。本研究采集柳树花粉、纯化提取蛋白质,腹腔注射免疫小鼠、滴鼻激发小鼠。通过对小鼠鼻部症状观察评分、光学显微镜观察鼻黏膜局部病理学变化发现,过敏原激发后,小鼠出现明显抓鼻、打喷嚏、流鼻涕等症状,并且次数较多,鼻黏膜层充血增厚,炎性细胞浸润,这些结果均表示成功建立柳树花粉致敏的过敏性鼻炎小鼠模型。

成功建模后,通过递增变应原剂量的方法皮下注射小鼠,目的是使其产生免疫耐受,从而达到治疗过敏性鼻炎的目的。通过动态监测小鼠鼻部症状、鼻黏膜组织形态学变化,发现小鼠抓鼻和打喷嚏的次数逐渐减少直至消失、鼻黏膜中嗜酸性粒细胞逐渐减少[16],最后无炎性细胞浸润,说明脱敏疗法治疗过敏性鼻炎是非常有效的一种方法。通过对小鼠血清中sIgE含量进行检测,我们发现,虽然处理的各阶段没有统计学差异(P＞0.05),但仍可以看到,实验组小鼠激发后血清特异性sIgE的含量有升高的趋势,脱敏治疗后血清中 sIgE含量有下降的趋势。由此推测,这可能是由于sIgE是微量抗体,血清含量的影响因素较多且不稳定所致。

本实验利用脱敏的原理,通过注射少量变应原,诱导致敏细胞仅释放微量活性介质,而不引起临床症状,短时间内多次注射,使致敏细胞内活性介质逐渐耗竭,从而消除机体致敏状态,成功使患过敏性鼻炎的小鼠得到免疫耐受。但由于临床上难于确定脱敏阶段变应原的剂量以及抗原,限制了脱敏疗法在临床上的广泛应用。