MRI活体示踪PEG/PEI-SPIO标记脂肪源性干细胞移植治疗AD大鼠模型

杜 磊，雷正贤，汤间仪，马伟琼，谭智霖，廖炎辉，王雅杰，谢 琦*

(1.广州市第一人民医院 华南理工大学附属第二医院南沙医院医学影像科，广东 广州 510180；2.香港大学深圳医院放射科，广东 深圳 518000；3.广州市中西医结合医院放射科，广东 广州 510800；4.惠州市中心人民医院放射科，广东 惠州 516001)

干细胞移植是治疗阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)的探索途径，活体动态监测干细胞移植后在AD宿主体内的分布、迁移及分化等是分子影像学研究方向。本研究通过观察聚乙二醇/聚乙烯亚胺修饰超顺磁性氧化铁(polyethylene glycol/polyethyleneimine modified superparamagnetic iron oxide, PEG/PEI-SPIO)标记的脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells, ADSC)移植后AD模型大鼠脑内MR活体示踪成像，探讨MRI活体示踪干细胞移植治疗AD的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及AD模型制作 SPF级SD雌性大鼠100只，体质量(200±20)g，2月龄，购自广东省医学实验动物中心[许可证号：SCX(粤)2013-0002]。随机选择80只，参照文献[1-2]方法永久性结扎双侧颈总动脉，术后饲以含250 ppm Cu2+去矿物质水3个月，制成AD模型，最终存活并建模成功48只；对其余20只分离但不结扎双侧颈总动脉，术后正常饲养，最终16只存活(假手术组)。

1.2 ADSC移植 参照文献[3-5]方法获取ADSC并传至第3代进行鉴定，将PEG/PEI-SPIO[6]加入第3代ADSC共孵育12 h，普鲁士蓝染色提示PEG/PEI-SPIO对SD大鼠ADSC细胞内铁标记率达95%，细胞形态无明显改变，可用于移植实验。

将48只模型大鼠随机分标记组、非标记组和磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)组，每组16只，分别于侧脑室内注入3 μl含105个PEG/PEI-SPIO标记或未标记ADSC悬液及PBS。对假手术组不予特殊处理。

1.3 相关指标观察

1.3.1 行为学测定 ADSC移植后第7、14、21、28天，分别于4组中随机取4只大鼠行Morris水迷宫测试，并记录逃避潜伏时间[7]，测定空间学习记忆能力。

1.3.2 MRI 完成上述测试后行头部MR扫描。采用Siemens Vrio Tim 3.0T MR扫描仪，7 cm腕关节线圈，参照文献[2]方法定位、麻醉，行轴位扫描。参数：TSE T1W，TR 600 ms，TE 12 ms，FOV 70 mm×60 mm，矩阵256×233，层厚3.0 mm；TSE T2W，TR 3 700 ms，TE 109 ms，FOV 70 mm×60 mm，矩阵256×256，层厚3.0 mm；GRE T2*W，TR 520 ms，TE 20 ms，FOV 70 mm×60 mm，矩阵256×206，层厚3.0 mm；T2 mapping，TR 1 100 ms，TE 1 16.0 ms、TE 2 32 ms、TE 3 48 ms、TE 4 64 ms，FOV 70 mm×70 mm，矩阵256×206，层厚3.0 mm；GRE SWI，TR 120 ms，TE 45 ms，FOV 80 mm×40 mm，矩阵256×243，层厚0.7 mm。于T2 mapping图像海马、颞顶叶皮质、小脑区勾画ROI，使双侧尽量相近并测量其T2值，取平均值为最终结果。

1.3.3 标本处理与分析 完成MR扫描后各组取3只动物，以心脏灌流致死后，将鼠脑置于4%多聚甲醛中固定24 h，自视交叉纹状体到海马及小脑层面切片、石蜡包埋；另取1只脱颈处死，取海马、皮质、小脑冻存。①检测铁含量：采用普鲁士蓝染色，参照测量T2值ROI层面取大鼠相应部位切片4张，在高倍镜下(×400)随机于双侧海马、颞顶叶皮质、小脑各选取3个视野观察蓝染颗粒数量，以Image-Pro Plus 6.0软件获得灰度值作为铁含量；②AD生物标志物蛋白表达：采用免疫组织化学染色法，一抗为抗Tau抗体、抗β淀粉样蛋白抗体，以Image-Pro Plus 6.0软件分析灰度值；③神经巢蛋白(neuroepithelial stem cell protein, Nestin)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)蛋白表达：采用Western blot法，一抗为抗Nestin抗体、抗BDNF抗体，以Alpha软件分析目标带光密度值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。计量资料均符合正态分布，以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 逃避潜伏时间 细胞移植后第7、14、21、28天，标记组、非标记组、PBS组逃避潜伏时间均较假手术组延长(P均<0.05)，标记组与非标记组间差异均无统计学意义(P均>0.05)；标记组和非标记组第28天逃避潜伏时间均较PBS组缩短(P均<0.05)。其他时间点标记组、非标记组、PBS组间逃避潜伏时间差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠ADSCs移植后不同时间点逃避潜伏时间比较(±s，n=4)

表1 各组大鼠ADSCs移植后不同时间点逃避潜伏时间比较(±s，n=4)

组别逃避潜伏时间(s)移植后第7天移植后第14天移植后第21天移植后第28天标记组29.08±2.76*24.89±2.27*25.26±0.94*19.48±0.86*#非标记组29.66±1.45*25.32±3.77*25.30±3.66*19.06±1.71*#PBS组29.45±3.59*25.50±4.21*25.20±1.31*25.16±2.41*假手术组16.83±0.7816.17±0.6016.71±1.1116.29±1.45F值108.78435.26252.87167.816P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：*：与假手术组比较，P<0.05；#：与PBS组比较，P<0.05

2.2 T2值 各序列图像4组大鼠各脑区均见散在斑点状低信号(图1～4)。标记组海马区T2值移植后第14、21、28天较第7天缩短，且较其余3组均缩短(P均<0.05)；颞顶叶皮质区各时间点T2值较其余3组缩短(P均<0.05)，第21、28天T2值较第7、14天缩短(P均<0.05)；各组间、各时间点间小脑区T2值差异均无统计学意义(P均>0.05)。移植后第7、14天，标记组颞顶叶皮质区T2值较海马及小脑缩短(P均<0.05)，第21、28天海马区T2值较颞顶叶皮质及小脑缩短(P均<0.05)。各脑区各时间点非标记组、PBS组、假手术组间T2值差异无统计学意义(P均>0.05)。

图1 假手术组大鼠颅脑MRI A～D及E～H分别为大脑和小脑T1WI、T2WI、T2*WI、SWI，均见散在斑点状低信号(箭)

图2 标记组大鼠颅脑MRI A～D及E～H分别为大脑和小脑T1WI、T2WI、T2*WI、SWI，均见散在斑点状低信号(箭)

图3 非标记组大鼠颅脑MRI A～D及E～H分别为大脑和小脑T1WI、T2WI、T2*WI、SWI，均见散在斑点状低信号(箭)

图4 PBS组大鼠颅脑MRI A～D及E～H分别为大脑和小脑T1WI、T2WI、T2*WI、SWI，均见散在斑点状低信号(箭)

2.3 脑标本检测指标

2.3.1 铁含量 4组大鼠各脑区均见散在蓝染颗粒。相同时间点标记组各脑区铁含量均较其余3组增高(P均<0.05)。标记组移植后第14、21、28天海马区铁含量均较第7天增高，且第21、28天均较其余部位增高(P均<0.05)；皮质区第7、14天铁含量均较第21、28天增高，且均较其余部位增高(P均<0.05)；小脑区不同时间点铁含量差异均无统计学意义(P均>0.05)。各脑区各时间点非标记组、PBS组、假手术组间铁含量差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.3.2 Aβ、Tau蛋白表达 4组大鼠各脑区均见散在棕色阳染细胞。标记组、非标记组、PBS组皮质区移植后第7天、小脑区第21天Aβ蛋白表达，海马区第21天及皮质区第7、21、28天Tau蛋白表达，均较同时间点假手术组增加(P均<0.05)。组间各时间点海马区Aβ蛋白表达、小脑区Tau蛋白表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.3.3 Nestin、BDNF蛋白表达 海马和皮质区标记组、非标记组各时间点BDNF蛋白表达及第14、21天Nestin蛋白表达均较PBS组增加(P均<0.05)，其余组间BDNF、Nestin蛋白表达差异无统计学意义(P均>0.05)；小脑区各时间点4组间Nestin、BDNF蛋白表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。

3 讨论

3.1 干细胞及示踪剂选择 ADSC与间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)相似[8]，且具有易获得、对机体损伤小、易于诱导分化等优点，适用于自体细胞移植治疗。为获得良好示踪效果，MRI活体示踪技术所用磁性标记物需不影响细胞活性且可被细胞良好吸收、内化。SPIO常用于干细胞标记[9-11]，但未经修饰的SPIO颗粒和细胞膜表面均带负电荷，不能有效标记干细胞。张宝林等[6]以PEG为溶剂，以乙酰丙酮合铁为铁源，加入PEI对SPIO进行修饰，使其表面带正电荷，可有效标记表面带负电荷的ADSC，并已经验证[3,5,12]。本研究Morris水迷宫结果显示，各时间点标记组与非标记组逃避潜伏时间差异无统计学意义，提示移植PEG/PEI-SPIO标记ADSC未对AD模型鼠学习和记忆行为产生显著影响，在活体上验证了其安全性。

3.2 铁含量分析 MRI示踪技术现已广泛用于活体示踪[13-14]。脑内铁含量增加与AD特征性神经元纤维缠结和老年斑有关[15-16]。本研究中标记组海马和皮质区T2值较其余3组缩短，提示将PEG/PEI-SPIO标记ADSC在移植入AD模型大鼠脑内后分布于海马和皮质，并可通过MR测量T2值对其示踪。标记组皮质区移植第7天T2值较其余3组缩短，至第14天T2值最短，而海马区自第14天始T2值较其余3组缩短，表明标记后干细胞可能先分布到额颞叶皮质区，而后向海马区迁徙；相同时间点各组小脑T2值差异无统计学意义，提示观察时间点内移植干细胞尚未大量迁移到小脑。既往研究[17-18]发现，在多种细胞信号影响下，移植入脑内细胞可定向迁移至病变部位。普鲁士蓝染色是显示组织内铁离子的敏感方法[19-20]，可与MRI结果相互验证但不能完全对应。

3.3 病理学评价 Aβ和Tau蛋白在AD发生发展中具有重要作用，是诊断AD的生物标志物[21]。本研究中移植后同组各脑区不同时间点Aβ和Tau表达均未减少，但第28天模型鼠行为学(逃避潜伏时间)表现却有所改善，推测其原因可能为移植后ADSC在微环境影响下刺激脑组织，诱导、激活了脑组织内源性修复过程。

Nestin是神经干细胞的重要标志物[22]。BDNF是与运动和感觉神经元相关的重要神经营养因子，参与神经修复和保护[23]。本研究中移植后第14天海马和皮质区ADSC可能向神经元方向分化，移植后ADSC于第7天起BDNF因子表达增高，推测其可能促进神经元修复。

综上，PEG/PEI-SPIO可安全有效标记ADSC，并能通过MRI活体示踪其在SD大鼠AD模型脑内的分布和迁徙。单次干细胞移植可有效改善AD模型鼠行为学表现，但本次观察时间点内未达到正常衰老鼠行为学水平，尚待进一步研究。向活体AD模型大鼠脑内移植后，ADSC可分化为表达Nestin、BDNF因子的神经元样细胞，但并不减少Aβ、Tau蛋白表达。