微生物灭活方法研究进展

薛俊静，乔晋娟，李恒，孟祥英

(潍坊医学院医学检验学院，山东 潍坊)

0 引言

微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。新型冠状病毒肺炎[1]、埃博拉出血热[2]、SARS[3]等急性传染病导致全球经济、医疗损失巨大。近年来，人类在疾病的预防和治疗方面取得非常大的进展，但是由于微生物感染而导致的疾病仍旧发生不断，无论是最新出现还是重现的感染，一直缺乏有效的药物去治疗这种类似的微生物所致疾病，尤其是人们对于大量广谱性抗生素的滥用，使得许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁[4]。微生物不仅能够致病，而且能够造成食品以及水质污染。全球食源性感染每年近15亿，约10亿是由微生物感染所致[5]，另外，微生物灭活还作用于水质的处理[6]。因此灭活其中的微生物对人类饮食健康、疾病预防都非常重要。

1 微生物灭活方法

针对近年来人类对于微生物灭活需求的不断升级，新兴的抗微生物光动力疗法、低电压脉冲电场法、UV-PS体系灭活法、连续式超声场耦合法、三氯异氰尿酸法、连续式水热强化灭菌法相对其他传统的灭活方法具有很大的优势。本文就以上几种方法进行综述。

1.1 抗微生物光动力疗法

抗微生物光动力疗法(anti-microbial photodynamic therapy，APDT)是一种基于光动力疗法的原理杀灭病原微生物的新方法[7]。APDT通过破坏细胞壁、细胞膜结构，损伤微生物的DNA以及抑制酶活性来形成不可逆转的损失使之灭活[8]，该疗法的副作用小、抗菌谱的范围广并且能够提高微生物对药物的敏感性。对于诊治多重耐药菌提供了新的思路和研究方向。APDT中的光敏剂(photosensitizer，PS)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)可灭活结构不同的病原微生物，作用方式不尽相同。其中，APDT可渗入革兰氏阳性菌的细胞壁内起到灭活作用，PS内携带的阳离子可与革兰氏阴性菌所带阴离子相结合，将其灭活。真菌细胞的细胞壁通透性介于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间，PS同时具有亲水性和亲脂性，能够结合真菌细胞壁发挥作用。APDT在病毒中的主要靶点为表面蛋白，可与其结合，达到灭活作用。

研究表明，APDT的作用效果与许多因素均有联系。其中PS的理化性质表现最为明显[7]，对其进行适当修饰后，具有最佳的亲水性和亲脂性，有利于结合和摄取，作用效果非常好。带有适量正电荷的PS能更好地与微生物表面带负电荷的成分结合，从而有效发挥灭活病原微生物及耐药菌株的作用，并且PS携带粒子对革兰氏阳性菌的作用应满足其与膜上的磷壁酸数量相匹配，此时灭活效果最佳。另外，将适当金属离子、取代基及卤素等引入PS大环内，通过增强三线态量子产率可提高其介导的APDT的作用效果。除了通过对现有PS进行结构改变以增强APDT的作用效果外，也可通过添加无机盐来增强PS介导的APDT作用效果。APDT不仅具有创伤小、靶向性、可重复使用等优点，而且不产生耐药性，有望成为传统药物的代替疗法，且临床已将此法应用于皮肤科[9]。

1.2 低电压脉冲电场法

低电压脉冲电场是一种新兴的非热低温灭菌法[10]。低电压脉冲电场作用于微生物的细胞膜，通过电穿孔使细胞膜的通透性增加，细胞吸水胀破，微生物裂解达到灭活的目的。此法采用低热的方法实现了低耗能、低污染，安全指数也非常高，并且能有效减少食物中营养成分的破坏，近年受到广泛关注。在相对较低的电压范围内，电压、电容、电导率等均可作为大肠杆菌致死率的影响因素[11]。随着电压的升高，通过影响电场强度的增加，来促进微生物的灭活，且效果明显。然而，随着电容的增加，大肠杆菌的致死率会呈现出先增大后减小的状态，在400 μF时灭活效果最佳，电容的改变导致电能量的改变，通过电能量的改变来影响低电压脉冲电场的杀菌效果。此外，随着电导率的增加，大肠杆菌致死率逐渐减小，当介质电导率超过一定的范围后，低电压脉冲电场将无法有效杀灭大肠杆菌。目前低电压脉冲电场的杀菌效果还难以达到商业无菌水平，因而如何进一步改进处理室结构、提高杀菌效果，以及如何实现高通量处理仍需进一步研究。

1.3 UV-PS体系灭活法

UV-PS(紫外联合过硫酸盐)体系灭活法是在紫外线灭活的基础上，克服其复活缺陷的一种改良方法。UV-PS体系杀菌首先是使细胞结构破损，细胞膜破损后进入胞内实现对其内容物及DNA的氧化破坏，进而导致细胞的死亡。研究表明，紫外线灭活(UV)法对大肠杆菌有一定的影响，但经紫外线照射后，大肠杆菌细胞膜仍保持一定的完整性，为复苏提供保障，使其灭活效果差，出现了修复复活现象[12]。而UV-PS体系杀菌效率高于单独UV杀菌及单独过硫酸盐(PS)杀菌。此法不仅灭活效率高，且光复活能力明显下降，具有一定研究价值。用UV-PS体系灭活水中大肠杆菌[13]，其主要影响因素为PS的初始浓度、初始PH以及Fe2+。在紫外剂量相同的条件下，一定范围内PS的初始浓度越高，其灭活效果越好。相反，Fe2+的浓度越高灭活效果越差，Fe2+虽然能够作为活化剂增加SO4-，但是Fe2+对紫外线的吸收作用以及絮体的产生影响较前者更加明显，因此表现为抑制。另外，对于初始pH的作用效果，在中性条件下，灭菌效果最佳。除UV-PS体系灭活法以外，UV/H2O2灭活法[14]、UV-LED联合次氯酸钠灭活法[15]对微生物灭活也具有较好的作用效果。

1.4 植物精油及其成分抗菌法

植物精油及其成分为广谱抗菌活性的新型抗菌剂[16]，其灭活作用不是由一个特定的机制引起，而是作用于细胞的多个靶点，涉及整个细菌细胞的一连串反应[17]。首先作用于细菌细胞壁，植物精油对其作用方式有多种，主要为抑制植物细胞壁合成以及干扰其中的蛋白质合成表达，从而限制细菌的正常生理活动。细胞膜通常是精油作用最关键的靶点，精油通过影响膜上蛋白质和脂质分子使膜的硬度和渗透压增加，最终使细胞膜的流动性和渗透性功能丧失。对细菌而言，DNA是其生长发育、遗传代谢过程中发挥重要作用的信息载体，它的任何损伤都会直接影响菌体的活性，植物精油则通过破坏细菌的DNA结构妨碍DNA修复[18]或抑制其基因表达来促进细胞溶解。此外，植物精油还作用于细菌的代谢组、分裂基因、运动基因进而对病原菌的多种生命活动产生影响达到灭活的目的。

1.5 连续式超声场耦合法

连续式超声场耦合法是物理灭菌法和化学消毒技术的耦合。此法最基本的原理为空化作用灭菌，利用空化效应产生的瞬间高温和高压来灭活微生物。耦合技术不仅灭活效果好，而且不产生副作用产物，具有非常好的研究前景。连续式超声场耦合化学杀菌剂对大肠杆菌的灭活作用受到多种因素的影响[19]。随着剂量的增加，大肠杆菌的抑制作用更强，当剂量达到100mg/L时表现为重度抑制。而超声频率的影响机制相对复杂，由于超声频率越高空化阈值越大，对于大肠杆菌单独存在的水样，频率低的超声杀菌率反而比频率稍高的超声杀菌率大，但在富含大肠杆菌的共存水样中，由于对氯苯酚热解时可产生气体，此种气体充当气核时使超声空化阈值降低，超声杀菌去污效果整体随超声频率的增加而增大；当固定超声功率密度为15 W/L时，室温条件下，混频杀菌去污效果与单频超声杀菌去污效果相比，有明显的优势。同时，超声灭菌率与功率密度相关，随着功率密度的增加先增加后减小。此外，温度的作用效果也非常明显，在一定温度范围内，温度越高，超声杀菌去污的效果越明显。研究证明，连续式超声场耦合化学杀菌去污的连续性和稳定性非常好，但其中的空化作用机理尚未明确，因此，对其进行更深入的研究，有利于连续式超声场耦合法在临床上的广泛应用。

1.6 三氯异氰尿酸法

三氯异氰尿酸(Trichloroisocyanuric acid，以下简称TCCA)为高效消毒剂，因其具有消毒效果好、成本低、对环境无害等优点，可广泛应用于各类食品和水质的消毒。TCCA法的作用机制是破坏酶系统来抑制其新陈代谢，进一步灭活细菌。其灭活效果受到投放量、pH、温度、氨氮浓度的影响。当投放时间恒定为15min时，消毒效果随投放量的增加而增加，在2mg/L及以上浓度灭活效果最佳；当投放浓度大于2.5mg/L时，30min灭菌率达99.9%。其次，pH在一定范围(pH 6～9)内时，pH越小，灭活效果越好。温度对于灭活效果主要作用于化学反应速度，在10～30℃的范围内，温度越高，反应越快，消毒效果越好。相反，在一定时间内，氨氮浓度越高，消毒效果越差。与传统的氯制消毒剂相比，TCCA法具有非常好的应用前景。此法同时应用于临床灭活多药耐药菌，且浓度为500mg/L时效果最佳[20]。

1.7 连续式水热强化灭菌法

连续式水热强化灭菌法是针对COVID-19持续阶段研究的微生物灭活法。可实现水样内微生物的完全灭活[21]，操作简便，能为临床应用提供有效帮助。该方法采用水热强化试验装置完成灭活，灭活过程温度的控制是灭活微生物的关键，油浴加热，设置四组平行对照(120、140、160、180℃)30min，灭活率均为100%，且经过24h培养后结果仍为阴性，这表明连续式水热强化灭菌法可使样本微生物几乎不再具有复活和繁殖能力，灭菌效果符合实际应用要求。

2 小结

综上所述，近年来对于微生物灭活的研究有非常大的进展，微生物灭活方法涉及领域更加广泛，国内对微生物灭活的实际应用方面也逐步完善，但针对某些研究方法的作用机制尚未明确，微生物灭活方法的改良研究尚有缺陷，因此，为达到更好的灭活效果，对微生物灭活的实际应用研究，我们需要更进一步的了解，以找寻更好的灭活方法。