基于数据挖掘和网络药理学的失眠中药配方规律及作用机制研究

浙江中医药大学药学院 杭州 310053

失眠是指对睡眠质量或睡眠时间不满意的一种主观体验，并伴有一种或者多种症状（入睡困难、难以维持睡眠或早醒）[1]。失眠症是最常见的睡眠障碍，目前失眠症的患病率约为10%，并且一直呈上升趋势，大约6%的人被诊断为慢性失眠[2]。研究表明失眠与慢性疼痛相关，对心血管和精神疾病的发展造成一定的风险[3-4]。药物是治疗失眠的一个重要手段，虽然很多新药成为入睡及睡眠维持困难患者的新选择，但是目前常用于治疗失眠的西药仍然存在较多的不良反应，如药物耐受和依赖、停药复发等[5]，因此，疗效好而副作用小的失眠治疗药物有待进一步开发研究。失眠属于中医“不寐”的范畴，研究表明中医药辨证论治在改善睡眠质量方面疗效确切[6-7]。中药的作用温和而安全，被大众所广泛接受，而且有着多靶点、多环节、多通路的特性，祖国历代医家对不寐病机的辨识和遣药组方又略有不同，故中医治疗失眠的作用机制有待进一步明确。

本研究运用数据挖掘结合网络药理学方法，发掘多个数据库中治疗失眠中药潜在的配伍规律及其作用机制。通过构建“中药成分-靶点-疾病”网络模型[8]，对药物潜在作用靶点进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以期阐明治疗失眠常用中药的分子机制，为临床合理用药、中药新药开发和药效物质基础研究提供参考。

1 数据和方法

1.1 数据来源与数据库 本研究以《中国知网中药方剂知识库》《中国方剂数据库》《方剂现代应用数据库》（2020-05-20）为中药方剂来源；在中国期刊全文数据库中，通过计算机检索关键词“失眠”“中药”，获得失眠相关主题词“失眠、不寐、不得眠、不得卧、不得睡、目不瞑”[9]，然后分别在《中国知网中药方剂知识库》《中国方剂数据库》《方剂现代应用数据库》中以主治功能进行检索，录入编号、方名及药物组成信息，删除单味药和组成重复的处方，在Excel 2019中建立数据库。为确保数据准确性，对数据录入进行双人核查。

1.2 数据标准化 依据《中国药典》2020版第一部和全国高等中医药院校规划教材《中药学》第10版对中药名称和功效分类进行规范化处理，例如“桂圆肉”统一为“龙眼肉”，“黄耆”统一为“黄芪”。因中药炮制后其功效和性味等发生改变，故统计时将不同炮制品分开统计，如甘草和炙甘草、生地黄和熟地黄分开统计。

1.3 用药规律统计分析 通过Excel 2019进行用药频次分析，将中药按照功效不同进行归类；通过SPSS Modeler 18.0以Apriori算法建模，建立 “数据源→类型→Apriori→网络”的关联规则数据流，根据支持度和置信度，对核心中药（频数≥40次）进行关联规则分析[10]；运用SPSS Statistics 25.0对核心中药进行聚类分析。

1.4 高频中药作用机制研究 结合中药频数统计、关联规则和聚类分析结果，以分析得到的高频药对和药组为研究目标，利用中药分子作用机制生物信息学分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of TCM，BATMAN-TCM） （http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php），设定预测候选目标（包括已知目标）的得分不小于每个成分得分分界的20%[8，11-12]，收集高频中药所含化合物和相对应的靶点。运用BATMAN-TCM将核心高频药组的活性成分及其作用的靶点和疾病作为节点（node），成分和潜在靶点的相互关系作为边（edge），构建“成分-靶点-疾病”网络模型图。此外，采用BATMAN-TCM对核心高频药组进行GO和KEGG通路富集分析，对药物作用靶点或差异表达基因进行信号通路分析，阐明核心高频药组治疗失眠疾病的作用机制，并利用Image GP在线绘图工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）依次绘制“高频药组治疗失眠涉及的细胞组分”分析图、“高频药组治疗失眠涉及的分子功能”分析图、“高频药组治疗失眠的生物学过程”分析图、“高频药组治疗失眠的通路富集”分析图。

2 结果

2.1 药物频次分析 共筛选出有效处方853首，涉及469味中药，药物总频数7 467次，核心中药（频数≥40次）共有46味，使用频数排名前10味中药为人参、茯苓、酸枣仁、当归、甘草、麦冬、炙甘草、生地黄、远志和白芍，并计算频率（即每味中药频数与处方总数之比）。见表1。

2.2 常用中药类别分析 按中药功效分类为标准，将频数≥5的中药进行分类，治疗失眠的中药类别主要有补虚药、安神药、清热药、化痰止咳平喘药、解表药、活血化瘀药、收涩药、平肝息风药、理气药、温里药。计算频率（即每一类别中药频数与中药总频数之比）与累计频率（即每一类别中药频率与其所有前项中药类别的频率之和）。见表2。

表1 频率≥10%的常用中药Tab.1 Herbs used with frequency greater than 10%

2.3 关联规则分析 基于SPSS Modeler 18.0软件，以Apriori算法建模，设置支持度＞8，置信度＞60，最大前项5，得到药对关联规则6条，3味中药药组关联规则13条。见表3、4。支持度表示数据出现的频率，置信度表示数据的可信程度。按照出现频数大小排序，常用药对有远志→酸枣仁、白芍→当归、茯神→酸枣仁、茯神→人参，其中出现频次最高的为远志→酸枣仁，出现148次，同时支持度最大。30种药药组以远志、当归→酸枣仁的置信度最大，支持度最高的为远志酸枣仁→当归。提升度则表示数据前项出现的同时数据后项出现概率的提高倍数，所有中药组合规则的提升度＞1，表明各个规则前后项之间存在关联，并且提升度越大，关联性越强。

表2 治疗失眠核心中药类别Tab.2 Categories of herbs frequently used for treatment of insomnia

表3 药对关联规则分析Tab.3 Association rules of drug pairs

表4 3味中药药组关联规则分析Tab.4 Association rules of three drug pairs

2.4 聚类分析 使用SPSS Statistics 25.0对频数≥40的核心中药进行聚类分析，基于系统聚类法中的Ochiai算法，结合中医药理论分析最终得到15个方剂，并绘制中药聚类树状图。见表5、图1。

2.5 基于网络药理学的治疗失眠高频药物作用机制探讨

2.5.1 高频中药成分-靶点-疾病的构建 结合中药频数统计、关联规则和聚类分析结果，确定远志、酸枣仁、当归为治疗失眠的常用药组，而且三者为高频中药，远志→酸枣仁为最常用药对。根据BATMAN-TCM在线分析结果可知，远志、酸枣仁、当归共涉及271个化合物，其中有结构信息的化合物187个，可用于目标预测分析。远志59个化合物，28个无结构信息；酸枣仁51个化合物，14个无结构信息；当归163个化合物，43个无结构信息。设置调整P值＜0.05，绘制远志、酸枣仁、当归三者成分-靶点-疾病网络图。见图2。潜在靶点涉及的疾病共7种，包括神经退化性疾病、心脑血管疾病、乳腺癌、疼痛等相关疾病，结果与远志、酸枣仁和当归治疗的疾病较为符合。

表5 失眠方剂聚类分析树状图中药提取Tab.5 Results of herbs extracted from the tree diagram of cluster analysis

2.5.2 GO和KEGG通路富集分析 对靶点进行GO分析（P＜0.05）得到30个细胞组分（cellular component，CC）、40个分子功能（molecular function，MF）、68个生物过程（biological process，BP）。CC主要包括细胞器、细胞质、细胞膜、细胞核、线粒体、细胞骨架、细胞质膜囊泡、核染色体等。见图3A。MF主要富集在离子结合、蛋白质结合、酶结合、信号转导活性、转录因子结合和活性等功能等方面。见图3B。BP富集所得结果与细胞氮化合物的代谢过程、生物合成过程、信号转导、小分子代谢过程、应激反应、细胞分化、增殖、凋亡、神经系统和免疫系统过程等密切相关。见图3C。

进一步对靶点进行KEGG富集分析得到通路205条，排名前25条通路见图3D。KEGG通路富集分析提示，远志、酸枣仁、当归可能作用于包括神经活动配体-受体相互作用，钙信号通路、磷酸肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路、环鸟苷酸-蛋白激酶G（cyclic guanosine-protein kinase G，CGMP-PKG）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、催产素信号通路、甲状腺激素信号通路、叉头盒O类（Forkhead box protein O，FoxO） 信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路、内源性大麻素信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate-activated protein kinase，AMPK）信号通路等涉及调节神经系统的通路；以及调节多巴胺（dopamine，DA）能突触、血清素能突触、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能突触、心肌收缩、昼夜节律；调控肌动蛋白细胞骨架、心肌细胞中的肾上腺素信号传导、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞内噬作用、细胞周期，还包括嘌呤、碳、精氨酸和脯氨酸代谢等多种基础代谢过程，与提高机体的免疫功能相关。

3 讨论

图1 治疗失眠中药聚类树状图Fig.1 Tree diagram of TCM cluster analysis for treating insomnia

现阶段，失眠症患者基数大，失眠还可诱发多种严重疾病，因此有效的药物治疗和控制显得尤为重要。祖国医学治疗失眠症有着悠久的历史，早在《黄帝内经》上便有相关记载，并积累了大量的文献资料、医案处方以及丰富的经验[13]。各医家对失眠症的病因病机有着深入的认识，却又不尽相同，主要观点有情志不畅、肝失疏泄、邪气致病、体质因素等，认为失眠的基本病机为脏腑阴阳失调、气血不和、阴阳不交、阳难入阴而致心神不宁[14]。失眠之病位主要在心，与肝、脾、胃、肾、胆等密切相关，脏腑失调，皆可导致不寐。五脏涵养五神，神明不安则病发[15]。中医通过辨证论治将失眠分为虚、实两类，多为虚实夹杂证，根据辨病调整适宜患者的处方用药，从而准确治疗不同病因引起的失眠症，并取得较好的疗效。鉴于失眠病机复杂，中医临床诊治过程中所形成的中药方剂略有不同，且作用机制有待进一步研究，故本研究主要探讨了三个数据库中治疗失眠方剂的用药规律及高频中药潜在的作用机制，旨在为防治失眠中药新药的开发和临床应用提供研究思路。

根据频次统计分析可知，治疗失眠的中药以补虚药（人参、当归、甘草、麦冬），安神药（酸枣仁、远志、朱砂）和清热药（生地黄、黄芩）为主。其中补虚药主要针对气血、阴阳两虚的失眠患者，例如人参养荣汤（《太平惠民和剂局方》）、炙甘草汤（《伤寒论》）。有研究表明人参糖蛋白通过调控大脑代谢，显著改善小鼠的睡眠质量[16]。酸枣仁的抗失眠作用已经被广泛研究，发现酸枣仁可通过突触界面靶向多种神经递质受体，从而发挥镇静和催眠的功效[17]。茯苓为双五茯苓膏的主药之一，运用茯苓治疗失眠的用药频数位居第二位，其有利水渗湿、健脾宁心之功效，既往研究表明能改善小鼠睡眠质量且安全性良好[18]。

基于核心中药关联规则分析发现，药对远志→酸枣仁出现的频数最大，支持度最高，说明其为治疗失眠症的最基本药对，其余为白芍→当归、茯神→酸枣仁、茯神→人参、黄芪→人参。有研究证明，酸枣仁-远志药对中提取所得总黄酮和总皂苷可以明显增加小鼠30min的入睡率，并缩短其睡眠潜伏期，延长睡眠持续时间，并可能是通过调控大脑神经递质5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、GABA、DA在脑组织中的比例和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成从而发挥镇静安神作用[19]。治疗失眠的3味中药药组有远志、酸枣仁→当归，酸枣仁、当归→远志，酸枣仁、茯苓→人参等，主要以补虚药为主，重用安神药，并佐以利水渗湿药，通过补益心气、安神益智、交通心肾等治疗失眠症，如开心散（《备急千金要方》）。聚类分析共得到15个方剂，主要治则为调理脏腑阴阳，包括宁心安神、益智、交通心肾、补脾益气、清热凉血等，治法有虚者补之、实者泻之、逸者行之。如C4药组由茯苓、半夏、陈皮、枳实和甘草组成，是温胆汤（《三因极一病证方论》）的主要成分。《内经》曰：“胃不和则卧不安。”又曰：“阳气满不得入于阴，阴气虚故目不得瞑。”半夏能和胃而通阴阳，茯苓补益心脾而宁心安神，从而发挥抗失眠作用。C8药组以补虚药（人参、麦冬）配伍安神药（酸枣仁、远志），佐以利水渗湿药（茯神），有安神益智、交通心肾、养心补肝之功效，如天王补心丹（《摄生秘剖》）。

基于生物信息学方法研究发现，常用高频药组远志、酸枣仁→当归配伍所富集的疾病中，神经退化性疾病、心脑血管疾病、乳腺癌、疼痛等与失眠都具有相关性。研究表明睡眠不足会加速神经退化性疾病的进展，两者之间存在着复杂的双向关系[20-21]。GO和KEGG富集分析表明，远志、酸枣仁、当归3味中药可以参与多种生物学过程，作用于多个靶点，同时在不同的信号通路中发挥治疗疾病作用，符合中药多成分、多靶点、多途径的特性。

图2 高频中药成分-靶点-疾病网络Fig.2 High-frequency use of TCM ingredients-targets-diseases network

图3-1 GO和KEGG通路富集分析Fig.3-1 Enrichment analysis of GO and KEGG pathway

图3-2 GO和KEGG通路富集分析Fig.3-2 Enrichment analysis of GO and KEGG pathway

综上所述，本研究基于数据挖掘结合网络药理学手段发现中药治疗失眠的配伍用药规律与中医临床辨治失眠基本一致，分析了失眠的基本病因病机，并深入探讨了高频药组远志、酸枣仁和当归配伍可能的作用靶点和信号通路，表明了中药复方通过合理配伍，主要通过调节机体的氨基酸等基础代谢和免疫系统，涉及调控DA能突触和GABA能突触等与神经系统疾病密切相关的功能，多成分、多靶点、多通路共同作用从而发挥治疗效果，所得结果有助于治疗失眠中药的开发研究和作用机制的阐明，为中医临床实践提供参考，并为进一步开展细胞或动物验证实验提供理论依据。