三七重楼生化汤对成纤维细胞功能的影响及机制研究

俞蕾媛 盛少琴 潘弘毅 刘佳俐 范梦梦 潘鸿燕

1.浙江中医药大学第二临床医学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学附属第二医院 3.浙江中医药大学第三临床医学院 4.云和县中医院

剖宫产后瘢痕缺损（previous cesarean scar defect，PCSD）是指剖宫产切口愈合不良，形成缺损。再次妊娠时，若孕囊种植于缺损处，则可导致大出血、子宫破裂，甚至孕产妇死亡[1]。目前临床上尚缺乏治疗PCSD的可靠方法，因此如何有效防治疗PCSD成为临床迫切需要解决的难点。剖宫产术后子宫切口愈合是一个多细胞参与的复杂过程，由于平滑肌组织再生能力较弱，大部分愈合以纤维性修复为主。创伤愈合早期，富含毛细血管的肉芽组织可在短时间内填补创面，维持组织器官完整性，同时可以预防感染，其形成有赖于成纤维细胞的迁移、黏附、增殖及愈合相关蛋白的分泌[2-3]。因此，促进成纤维细胞的迁移、黏附、增殖及愈合相关蛋白的分泌，将有助于促进子宫切口愈合。

中医认为本病多由血瘀所致，兼夹气血亏虚，治疗当以益气养血、化瘀生新为主，辅以清热解毒。三七重楼生化汤（Sanqi Chonglou Shenghua Decoction，SCD）为我科经验方，该方由生化汤加味而成，具有抗炎抑菌、化瘀生新之效，可改善机体的血液循环状态，促进创面的愈合。临床研究已证实，该方对剖宫产术后子宫切口愈合不良、恶露不绝、子宫复旧不良等均有良好疗效[4-5]。但作为中药复方方剂，其药效机制尚不明确。故本研究拟体外培养小鼠成纤维细胞，探讨SCD对成纤维细胞功能及对细胞因子分泌的影响，为临床药理研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞 小鼠成纤维细胞系L929由浙江中医药大学附属第二医院中心实验室馈赠。选择含10%胎牛血清、100U·mL-1青霉素、100mg·L-1链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM），于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。定期观察细胞生长情况，每2d换液一次。

1.2 主要药品与试剂 SCD组方包括三七3g、重楼3g、当归20g、桃仁10g、川芎10g、益母草30g、黄芪10g、生姜6g、甘草6g，药物由浙江中医药大学附属第二医院药剂科提供。以上药物以去离子水常规煎煮2次，浓缩后过滤除菌、分装，-20℃保存备用。前期研究中采用细胞增殖检测实验筛选出SCD最佳浓度，分为低、中、高3个浓度梯度，分别为1.25、2.5、5mg·mL-1。DMEM高糖培养基、胰酶、胎牛血清均购于美国Gibco公司（批号：C11995500BT、25200056、10091-141）；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、青霉素链霉素溶液均购于杭州诺森德生物技术有限公司（批号：C10010、C15140）；β-肌动蛋白（β-actin）小鼠单克隆抗体、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）兔多克隆抗体、血管内皮生长因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）兔单克隆抗体、细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）兔多克隆抗体、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2（phospho-extracellular regulated protein kinases 1/2，p-ERK1/2）兔多克隆抗体、山羊抗兔二抗（goat anti rabbit IgG）、山羊抗小鼠二抗（goat anti mouse IgG）均购于美国Abcam公司 （批号：ab8226、ab179695、ab52917、ab17942、ab47339、ab205 718、ab205719）； 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术有限公司（批号：P0012）；细胞增殖检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购于日本东仁公司（批号：CK04）。

1.3 主要仪器 CO2细胞培养箱、生物安全柜为美国Thermo Fisher公司产品；倒置显微镜购于日本Olympus公司；实时无标记细胞分析仪购于美国ACEA公司；酶标仪购于美国BioTek公司；电泳仪为美国Bio-Rad公司产品；凝胶成像仪购于美国Protein Simple公司。

1.4 细胞增殖检测

1.4.1 实时细胞分析技术（real time cellular analysis，RTCA） 在96孔电子培养板中加入培养基获取基线数据，取对数生长期的L929细胞，按5×103个/孔细胞数接种于96孔培养板中，室温静置30min后置于RTCA仪上，37℃、5% CO2条件下连续监测24h。吸出原培养基，分别予低、中、高浓度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1），对照组予等体积培养基，继续监测24h，获取细胞指数（cell index，CI）。

1.4.2 CCK-8法 取对数生长期的L929细胞，按5×103个/孔细胞数接种于96孔板中，37℃、5% CO2孵育24h。吸出原培养基，分别予低、中、高浓度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1），对照组予等体积培养基，继续培养24h。更换培养基，每孔加入10μL的CCK-8试剂，37℃孵育2h，酶标仪测定450nm处的吸光度（optical density，OD）。

1.5 细胞黏附检测

1.5.1 RTCA 96孔电子培养板中加入培养基获取基线数据，取对数生长期的L929细胞，按2×104个/孔细胞数接种于培养板中，同时予低、中、高浓度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1），对照组予等体积培养基，37℃、5% CO2条件下连续监测5h获取CI。

1.5.2 CCK-8法 取对数生长期的L929细胞，按2×104个/孔细胞数接种于培养板中，同时加入低、中、高浓度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1），对照组予等体积培养基，37℃、5% CO2孵育5h后更换培养基，每孔加入10μL的CCK-8试剂，37℃孵育2h，酶标仪测定450nm的OD。

1.6 细胞迁移检测 采用划痕实验检测细胞迁移。取对数生长期的L929细胞，按2×105个/孔细胞数接种于6孔板中，37℃、5% CO2条件下培养24h，以200μL移液器吸头在培养板孔内划线，PBS洗涤3次，更换为含0.5%血清的培养基并加入低、中、高浓度（1.25、2.5、5mg·mL-1）SCD，对照组予等体积培养基，分别于12、24、36h拍照记录细胞迁移情况，以Image J图像处理软件进行定量分析。

1.7 Western blot检测愈合相关蛋白表达 取对数生长期的L929细胞，按3×105个/孔细胞数接种于6孔板中，培养24h后分别用低、中、高浓度SCD（1.25、2.5、5mg·mL-1）干预，对照组予等体积培养基。37℃、5% CO2培养24h后吸出培养基，PBS洗涤3次，加入放射免疫沉淀法缓冲液（radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA）后在冰上充分裂解。4℃下12 000r/min离心10min，收集上清液，BCA法测定总蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离后，转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），室温封闭2h，加入一抗4℃孵育过夜。次日，加入二抗室温孵育2h，洗膜后电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂显色。以β-actin为内参，对蛋白质条带的灰度进行半定量分析。

1.8 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用非配对双尾t检验；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时进一步两两比较采用最小显著差异（least significant difference，LSD）法，方差不齐时采用Dunnett法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖比较 CCK-8结果示：与对照组比较，SCD各浓度组L929细胞增殖能力显著提升（P＜0.01）。与低浓度组比较，中、高浓度组促增殖作用更显著（P＜0.01）。与中浓度组比较，高浓度组促增殖作用更显著（P＜0.05）。见图1A。

RTCA结果示：SCD干预后CI在短暂下降后上升。干预30h，与对照组比较，SCD低浓度组CI显著增高（P＜0.01）。干预36h，各组CI差异无统计学意义（P＞0.05）。干预42h，与对照组、SCD低浓度组比较，中、高浓度组CI显著增高（P＜0.01），但中、高浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）。干预48h，与对照组比较，SCD中、高浓度组CI显著增高（P＜0.01），但中、高浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）；与低浓度组比较，高浓度组CI显著增高（P＜0.05）。见图1B、表1。

2.2 各组细胞黏附比较 CCK-8结果提示，与对照组比较，SCD各浓度组L929细胞黏附能力显著提高（P＜0.01），但各浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2A。

RTCA结果提示，与对照组比较，干预各时点SCD各浓度组L929细胞黏附能力显著提高（P＜0.01），但各浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2B、表2。

图1 各组细胞增殖比较Fig.1 Comparison of cell proliferation in each group

表1 RTCA各时间点各组细胞增殖比较（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell proliferation at different time points of RTCA（±s，n=3）

表1 RTCA各时间点各组细胞增殖比较（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell proliferation at different time points of RTCA（±s，n=3）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与SCD低浓度组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note:Compared with control group，**P＜0.01;compared with SCD low dose group，#P＜0.05;##P＜0.01

组别 30h 36h 42h 48h对照组 1.06±0.07 1.20±0.03 1.36±0.01 1.62±0.09 SCD 低浓度组 1.46±0.04** 1.29±0.08 1.43±0.11 1.72±0.06 SCD 中浓度组 1.19±0.06## 1.29±0.10 1.76±0.08**## 1.90±0.08**SCD 高浓度组 1.09±0.13## 1.35±0.22 1.90±0.19**## 1.94±0.14**#

图2 各组细胞黏附比较Fig.2 Comparison of cell adhesion in each group

表2 RTCA各时间点各组细胞黏附比较（±s，n=3）Tab.2 Comparison of cell adhesion at different time points of RTCA（±s，n=3）

表2 RTCA各时间点各组细胞黏附比较（±s，n=3）Tab.2 Comparison of cell adhesion at different time points of RTCA（±s，n=3）

注：与对照组比较，**P＜0.01Note:Compared with control group，**P＜0.01

组别 1h 2h 3h 4h 5h对照组 0.02±0.01 0.03±0.01 0.04±0.01 0.05±0.01 0.06±0.01 SCD 低浓度组 0.07±0.01** 0.10±0.00** 0.12±0.01** 0.14±0.01** 0.17±0.02**SCD 中浓度组 0.07±0.01** 0.10±0.00** 0.11±0.00** 0.13±0.01** 0.16±0.01**SCD 高浓度组 0.08±0.01** 0.11±0.01** 0.13±0.01** 0.15±0.01** 0.18±0.02**

2.3 各组细胞迁移比较 干预12h，各组划痕愈合百分比差异无统计学意义（P＞0.05）。干预24h，与对照组比较，SCD中、高浓度组划痕愈合百分比显著增加（P＜0.05，P＜0.01）；且与低、中浓度组比较，高浓度组愈合百分比增加更明显（P＜0.01）。干预36h，与对照组比较，SCD各浓度组划痕愈合百分比均显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。与低浓度组比较，SCD中、高浓度组划痕愈合百分比显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。与中浓度组比较，SCD高浓度组划痕愈合百分比显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3、表3。

2.4 各组细胞VEGF、TGF-β1、ERK1/2、pERK1/2蛋白表达比较 各组细胞TGF-β1及ERK1/2表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，SCD中、低浓度组VEGF、p-ERK1/2的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组、SCD中、低浓度组比较，高浓度组VEGF、p-ERK1/2表达显著增加（P＜0.01）。见图4。

3 讨论

图3 各组成纤维细胞迁移比较（40×）Fig.3 Comparison of fibroblasts migration in each group（40×）

表3 各组划痕愈合百分比（±s，n=3）Tab.3 Percentage of wound area in each group （±s，n=3）

表3 各组划痕愈合百分比（±s，n=3）Tab.3 Percentage of wound area in each group （±s，n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与SCD低浓度组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与SCD中浓度组比较，△△P＜0.01Note:Compared with control group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with SCD low dose group，#P＜0.05，##P＜0.01;compared with SCD medium dose group，△△P＜0.01

组别 12h 24h 36h对照组 13.46±2.50 22.56±1.06 31.89±2.05 SCD 低浓度组 13.57±1.37 25.27±2.47 39.06±4.27*SCD 中浓度组 14.82±2.12 26.05±2.11* 44.60±2.94**#SCD 高浓度组 16.03±2.43 39.32±1.32**##△△ 53.17±1.26**##△△

图4 各组细胞VEGF、TGF-β1、ERK1/2、pERK1/2蛋白表达比较Fig.4 Comparison of VEGF，TGF-β1，ERK1/2，pERK1/2 expression in each group

PCSD 是剖宫产术后的远期并发症之一，严重影响妇女的身体健康及生活质量，同时会对再次妊娠带来子宫破裂和憩室妊娠的巨大风险。目前临床上尚缺乏治疗PCSD的可靠方法，因此如何有效预防PCSD、促进子宫切口愈合成为临床上亟需解决的难题。与其他类型的创伤愈合同样，剖宫产术后子宫切口愈合也是一个复杂有序的生物学过程，涉及多种细胞和生长因子。目前认为，创伤愈合遵循三个基本阶段，即炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段。成纤维细胞参与创伤愈合全过程，在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积与重塑、伤口收缩中发挥重要作用[6-7]。组织损伤时，成纤维细胞在炎症因子的介导下迁移到损伤部位并黏附于ECM上，增殖并合成分泌ECM和生长因子（VEGF、TGF-β1等）以促进伤口愈合，其生物学行为直接决定了组织修复的速度与质量。

中医认为创伤可致局部气血瘀滞、经络阻塞，故治疗首先需要祛瘀，否则“瘀血不去，新血不生”。“腐去肌生，肌平皮长”是创伤愈合的自然规律，故亦可予“去腐生肌”类药物治疗，加速坏死组织清除及肉芽组织生长[8]。三七重楼生化汤是我科自拟经验方，其中三七活血化瘀、和营止血，可以抑制受损组织释放自由基并能改善局部血液循环[9]；重楼清热解毒、消肿止痛，具有抑菌、抗炎、抗氧化的功效[10]。临床研究证实该方对PCSD具有良好疗效，但其作用机制尚不明确。本研究选取小鼠成纤维细胞L929作为研究对象，通过CCK-8、RTCA检测细胞增殖及黏附，结果提示：SCD干预后L929细胞增殖呈动态变化，在最初6h内低浓度SCD能促进L929细胞增殖；干预12～24h中、高浓度能促进L929细胞增殖，且SCD浓度越高，促进增殖作用越明显。黏附实验结果表明，SCD具有促黏附作用，但不同浓度间差异无统计学意义。划痕实验结果显示，在最初12h各组细胞迁移差异无统计学意义；干预24h，中、高浓度SCD表现出促进迁移的作用，且高浓度促进作用更强；随着干预时间达到36h，低、中、高浓度SCD均具有促进迁移的作用，且SCD浓度越高，作用越显著。由此推测，SCD可以促进成纤维细胞增殖、迁移、黏附，且其作用具有一定时间与浓度依赖性。干预后短时间内，药物浓度间差异并不显著，而随时间推移，逐渐表现出浓度依赖性，这一发现对临床用药时间间隔、剂量选择具有指导意义。

VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，可刺激血管生成并增加血管通透性，在创伤愈合过程中有利于营养物质及代谢产物的运输，从而改善伤口局部微环境；其非血管作用包括激活成纤维细胞，促进胶原蛋白沉积[11-12]。TGF-β1具有强烈促伤口愈合作用，可通过经典的转化生长因子-SMAD（transforming growth factor-SMAD，TGF-SMAD） 蛋白途径促进成纤维细胞合成和胶原分泌，有助于减少创面面积；同时还可促进成纤维细胞增殖和向肌成纤维细胞分化，提高创面张力，加速伤口闭合[13-14]。本研究通过Western blot技术检测SCD干预后成纤维细胞VEGF、TGF-β1蛋白的表达，结果提示低、中、高浓度SCD均不影响TGF-β1蛋白表达；高浓度SCD可显著提高VEGF蛋白水平，而低、中浓度SCD促进VEGF分泌的功效不明显。上述结果提示SCD可能通过上调VEGF表达来改善成纤维细胞的血供和氧供状态，同时刺激成纤维细胞的增殖、黏附、迁移，从而促进剖宫产切口愈合。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路广泛参与细胞病理生理效应[15]。研究证实，MAPK信号通路特别是ERK1/2的活化，对组织损伤后应激反应至关重要[16-17]。包括VEGF在内的组织损伤相关因子可激活ERK1/2信号通路，并通过促进细胞定向迁移、黏附、增殖等发挥促进创面愈合的作用。本研究发现低、中浓度SCD均不改变ERK1/2蛋白磷酸化水平，而高浓度SCD干预后，成纤维细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平明显上调，该结果提示SCD激活的成纤维细胞增殖、迁移、黏附可能与ERK1/2蛋白磷酸化增强有关，而ERK1/2蛋白磷酸化水平提高可能是VEGF表达上调的结果。

综上所述，本研究提示SCD能够明显提高成纤维细胞的增殖、黏附及迁移能力，并能上调愈合相关蛋白VEGF的表达，进而活化ERK1/2蛋白，发挥促进PCSD伤口愈合的功效，然而其确切机制仍不清楚，后续将进一步深入研究，为SCD的开发、应用提供实验依据，也为PCSD的防治提供更多可靠的方法。