苏云金杆菌的分类研究综述

2020-12-22顾晓峰阴启星孙兴民张娓娓王晓锋

现代园艺 2020年17期

顾晓峰，阴启星，孙兴民，张娓娓，王晓锋

（1 江苏句容市林业科技推广中心 212400；2 句容市磨盘山林场；3 江苏农林职业技术学院；4 句容市农业农村局）

苏云金杆菌简称Bt，其分类地位隶属于原核生物界厚壁菌门芽孢杆菌纲芽孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性菌。其形状呈杆状、具有内生芽孢。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）重要特性是能够杀死害虫。在第九版的《伯杰氏细菌鉴定手册》中，苏云金杆菌被归为第二类第十八群，属于芽孢杆菌属（Bacillus）中的一个种[1]。

1 其分类地位的争论

自1957 年以来，Bt 被划分成为独立种后，它的分类地位就存在很多争论，争论的重点在于Bt 和一种蜡状芽孢杆菌（Ba.cillus cereus）二者菌株形态、菌株生理生化等一些特征上差别很小，而且2 种菌有近缘性，二者之间区别只是在于Bt 能产生一定量的伴孢晶体。随着科技的不断发展和研究的不断深入，Bt 新菌株不断被研究者们发现，各式各样的分类方法也被研究者们不断提出，将人类有史以来发现的所有Bt 分别划分为不同的生物型、亚种、变种、血清型及致病型等。用来鉴定Bt 的主要方法有酯酶法、鞭毛抗原法、生理生化试验、PCR 鉴定、16srRNA/DNA 鉴定、染色体杂交等现代分子生物学方法。[1]

它与蜡状芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌的主要区别是：Bt 在形成芽孢的时候，会形成不规则形状的伴孢晶体。在Bt 杆菌体内能形成的伴孢晶体形状有菱形、方形、长方形、椭圆形等，其数量为1～2 个，甚至多个。Bt 伴孢晶体由不同分子量的多肽一原毒紊组成，每一种多肽都是单一基因编码的产物。苏云金芽孢杆菌广泛地分布在世界各处，从地上的土壤到空气中的灰尘，从河流到山川，从南极冻土到热带雨林，从平原到沙漠，各处均有分布，在整个地球上，其菌种和基因资源丰富，目前世界范围内大约有6 万个左右Bt 分离物。

2 其分类地位作为独立种的依据

苏云金杆菌在形成芽孢时体内形成的蛋白质伴孢晶体是其成为独立种的主要依据。尽管苏云金杆菌可以在不合宜条件下或在各因素的诱导下失去产生伴孢晶体能力，但不影响Bt 进行大规模发酵并成功作为生物杀虫剂的实际意义。虽然Bt 与蜡状芽孢杆菌非常相似，细菌学家一直坚持把它们归为一个种，但从经济意义和实际的需要出发，应用微生物学家却要保留Bt 和炭疽芽孢杆菌在芽孢杆菌属中作为独立种的分类地位。Baumann 等强调，协调应用微生物学家职业的需要和细菌分类可接受的实际情况是困难的，并认为Gordon 把Bt 作为蜡状芽孢杆菌的一个亚种很有价值，亚种可进一步细分为血清型，然而这些主张并没有被《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中采纳，继续保留了它们独立种的分类地位[2]。

3 苏云金杆菌分类进展史

苏云金杆菌的分类自从1946 年Smith 等按现代分类方法，将Bt 划入芽孢杆菌科，主张作为蜡状芽孢杆菌的一个变异体。1951 年，Toumanoff 等把他们的分离体命名为蜡状芽孢杆菌阿莱亚种，同时建议猝倒芽孢杆菌和BT 都作为蜡状芽孢杆菌的亚种。1958 年Heimpel 等提出了与蜡状芽孢杆菌有关的昆虫病原菌分类问题，同时列出检索分类表，然后Heimpel 等对产生伴孢晶体的病原细菌分类补充。Krieg 在1961 年综合出蜡状芽孢杆菌群的检索表。在此基础上，我国刘崇乐于1961 年对KriegDE 检索表进行了修订。后来，1962 年Barjac 等根据生理生化反应和鞭毛抗原（H）血清反应的不同，把Bt 划分为6 个亚群。后又区分为9个亚群。1973 年Barjac 等以鞭毛抗原的血清为依据参照生理生化反应和脂酶图型的不同，将Bt 划分12 个H 型。其中H3、H4、H5 型中存在着抗原亚因子，定为H3a 和H3a3b,H4a4b 和H4a4c,H5a5b 和H5a5c[3]。

1962 年用鞭毛抗原的血清学反应的方法将Bt 划分为6 个血清型；1972 年进一步细分为12 个血清型，l5 个血清亚种；1981 年为19 个血清型，25 个血清型亚种；1992 年为34 个血清型，43 个血清型亚种；1994 年为40 个血清型，54 个血清型亚种。近几十年来，世界各国的研究者们在世界各处采集并分离了大量的菌种，其血清亚种数增加较为迅速。但在发现的苏云金芽孢杆菌中，其新血清亚种占有量高达80%以上。

Hofte 和Whiteley1989 年根据42 个基因编码的氨基酸序列的同源性和杀虫谱双重标准将Bt 杀虫晶体蛋白基因划分为5 类14 亚类。其内具有溶血溶细胞作用的27kDa 晶体蛋白基因被命名为cyt 基因，其他只有杀虫活性的13 亚类命名cry 基因。cry 基因依据其4类特异性可划分4 群，依次为鳞翅目特异性、鳞翅目和双翅目特异性、鞘翅目特异性、双翅目特异性。当时基因数目发现的较少，相互之间差异较为明显，故而每个基因的分类地位比较明确，从而使Hofte 和Whiteley的分类系统在世界范围内被研究者们广泛的接受和采用。但随着Bt 新基因的不断发现，这种分类方法渐渐不能满足上述条件，使分类很难确定。到2004 年已发现299 种杀虫晶体蛋白基因，分属于44 群，136 模式基因[4]。截止到2007 年4 月，这些基因依据其核苷酸序列的同源性被分为53 类，396 种，其中cry 基因有372种，cyt 基因有24 种。而这种分类系统在同源性和杀虫谱分类原则之间存在一定冲突，在1995 年的国际无脊椎病理学会年会上，成立了以杀虫晶体蛋白基因而命名的委员会，同时依据氨基酸序列的同源性进行分类。其分类是以比较晶体蛋白氨基酸序列的同源性，以45%、78%和95%为界，通过计算机运用，将基因划分为4 个分类等级，依次用大写英文字母、阿拉伯数字、小写英文字母和阿拉伯数字表示已发现到的116 个杀虫蛋白基因，分别分布于Bt 不同菌株中。不同亚种之间、不同血清型，其基因数和种类都有明显差异。多个晶体蛋白基因定位于同一质粒上；或者同一菌株的杀虫晶体蛋白基因也可能定位于不同的质粒上；而有的则定位于染色体上，或同时存在于质粒和染色体上。

我国对Bt 的研究相对起步较晚，一些国家早在20 世纪50 年代前就已经开始对此研究。早在1955年，曹骥先生等从引进的法国商品制剂中就成功分离得到Bt 菌株，并在实验室制备成菌剂，后用来防治玉米螟取得良好效果。1959 年刘篙乐先生从捷克斯洛伐克引进苏云金杆菌亚种，在实验室培养扩繁后，大量制备成菌剂对杨天社蛾、菜粉蝶、松毛虫进行防治，效果显著。1964 年，由国家科委下达任务，在武汉建成了专门的生产苏云金杆菌制剂工厂。1965 年年底，武汉生产的“三五牌”和长沙生产的“424”苏云金杆菌生物杀虫剂在我国推广使用。同时中国林科院对此也进行了液体深层发酵的研究。

20 世纪80 年代，我国的Bt 生物杀虫剂研究、开发和利用都进入到较为稳定的发展阶段，武汉成为我国主要的Bt 杀虫剂生产基地。此外，湖北农科院也组织专家团队进行深入研究，他们研制和量产的Bt 液剂、粉剂等，不但发酵效率高，而且成本较低，同时还解决了生产过程中噬菌体污染问题和产品质量标准化问题。