我国蓝莓种质资源的分子标记研究进展

坤旭锋，邵征绩，章朝钧，陈小军，孙 杰，邝 曦，龙治坚

（1 西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010；2 西南科技大学竹类研究所）

蓝莓隶属于杜鹃花科越橘属植物，又名越橘、越桔、蓝浆果[1]。该植物原产于北美地区，在我国西南、东北以及长江流域的山区均有广泛的分布[2-3]。蓝莓的营养成分丰富，花青素含量较高，素有“浆果之王”的美誉[4]。我国蓝莓的研究起步较晚，生产上的栽培品种仍然以欧美等国家的为主。其栽培品种主要属于高丛蓝莓、矮丛蓝莓和兔眼蓝莓3 个类群[1]。经过几十年的研究，我国蓝莓在分子生物学方面的研究取得了阶段性的进展。鉴于此，综述蓝莓的分子标记研究进展，并对后续的研究进行展望。

1 分子标记技术的发展

近几十年，分子标记技术发展迅速，已由RAPD、AFLP、ISSR、SSR 等随机DNA 分子标记类型发展到SCoT、SRAP、CDDP、EST-SSR 等目的基因分子标记和功能性分子标记类型[5]。这些标记已经广泛应用于葡萄[6]、柑桔[7]、龙眼[8]等园艺作物遗传多样性分析、遗传结构和亲缘关系、指纹图谱构建、种质资源鉴定等方面。

2 分子标记在蓝莓中的应用进展

2.1 遗传多样性与亲缘关系

在蓝莓的遗传背景研究中，EST-SSR 标记应用相对较多。孙海悦等[9]开发越橘EST-SSR 引物，并分析其在越橘品种遗传多样性研究中的作用，结果表明：17对引物在供试越橘种质中扩增出理想的PCR 产物，17对引物均有多态性；而在DICE 为0.69 处，供试的种质资源聚为4 类。孙海悦等[10]扩大供试材料，再次利用EST-SSR 标记分析遗传多样性，发现55 对引物在供试越橘种质中扩增出清晰的条带，且具有多态性。聚类发现在DICE 为0.70 处，供试越橘种质分别聚为两大类。孙英新等[11]利用EST-SSR 标记研究6 个蓝莓品种的遗传多样性，结果表明：13 对引物共获得65 条条带，多态性条带为53 条，比率为81.5%；PIC 为0.513～0.887，遗传分化系数平均值为0.137，基因流的平均值为1.567。刘有春等[12]基于EST-SSR 标记研究越橘栽培种和中国野生种的遗传结构差异，结果表明：8 对引物共检测101 个等位变异，平均为12.63，Ne、I、Ho、He 等遗传多样性指数平均值分别为8.711、2.262、0.523 和0.860。同时，越橘种质资源内部存在明显的遗传结构差异，4 个类群与材料的抗寒性、低温需冷量特性等有明显的对应关系。从国外引进的越橘栽培种和我国野生种间存在一定程度的基因交流。这说明国内外的越橘种质资源遗传背景差异较大，但尚未形成生殖隔离，为杂交育种提供了丰富的亲本选择，也为该果树种质资源的创制奠定基础。耿金曼[13]利用EST-SSR标记研究13 个蔓越橘品种的遗传背景，结果表明：每个EST-SSR 位点的等位基因范围在7～12 个，平均每对引物检测到等位基因数为10.29 个；聚类分析发现13 个蔓越橘品种间的相似性系数范围为0.28～1.00，并在相似系数为0.74 时，可将13 份蔓越橘材料分为4大组。郭瑞雪[14]基于55 对EST-SSR 引物分析越橘品种，结果表明：在遗传相似系数（DICE）为0.81 处，84个供试品种聚为4 大类，其中半高丛越橘和高丛越橘聚为1 类；2 个高丛越橘品种聚为1 类；而矮丛越橘、兔眼越橘品种分别聚为1 类。同时，聚类结果基本与越橘的分类相一致。这表明EST-SSR 标记可以用于蓝莓种质的鉴定与遗传多样性分析。

SRAP 标记自开发以来，被用于数十种植物的遗传多样性和亲缘关系研究。在蓝莓上也有相应的应用。傅冰等[15]以9 个品种蓝莓为试材，优化了蓝莓SRAP-PCR 反应体系，并利用该体系分析了供试蓝莓品种之间的遗传多样性，结果表明：9 个品种蓝莓的遗传相似性系数在0.1818～1.0000 之间，平均为0.6359，说明材料存在较高的遗传多样性。UPGMA 聚类可将供试材料分为4 个类群，其结果与主坐标分析相一致。张鲁杰等[16]采用15 对SRAP 引物对21 个蓝莓栽培品种进行遗传多样性及亲缘关系分析，发现21 个品种共获得207 条带，其中多态性条带172 条，多态性比率83.1%。平均等位基因数为1.82，有效等位基因数为1.47，Nei's 基因多样性指数为0.27，Shannon's 平均信息指数为0.41。UPGMA 聚类结果与已知蓝莓杂交系谱基本相吻合。李红侠等[17]利用SRAP 标记，对来源不同的14 份蓝莓种质的亲缘关系进行了分析，5 对SRAP引物共扩增96 条条带，其中多态性条带有71 条，多态性比率为73.96%。在相似系数为0.55，可将14 份蓝莓分成3 类，第1 类有3 份种质，第2 类有2 份种质，第3 类共9 份种质，聚类结果与形态分类的大致吻合。尹德洁[18]利用SRAP 标记研究75 份蓝莓和2 份红豆越橘的遗传背景，发现栽培品种的 DICE 介于0.5670～0.8774 之间；野生材料的DICE 范围为0.6207～0.9387；而栽培与野生材料的DICE 则为0.3525～0.4751。进一步分析表明，DICE=0.57 处，供试材料聚为3 个类群，即栽培蓝莓品种类群、野生蓝莓类群以及红豆越橘类群。聚类结果与材料的系谱、材料的类型存在一定的相关性。

除了EST-SSR 和SRAP 标记以外，尚有其他标记应用于蓝莓的遗传背景研究。韩国辉等[1]为建立蓝莓SCoT 标记分析体系，对影响蓝莓SCoT-PCR 反应的Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、模板DNA 及引物等因素进行优化筛选，建立了适用于蓝莓遗传分析的SCoT-PCR 扩增体系。房文秀等[19]基于CDDP 标记，研究蓝莓种质资源，结果表明：在32 份供试材料中，17条CDDP 引物共扩增出207 条条带，多态性条带占比90.82%，特异条带占比8.21%。同时，CDDP 标记在蓝莓中具有较高的多态性及特异性，与种质的需冷量、抗寒性及果实颜色具有一定的相关性，2 条引物组合可以完全区分32 种蓝莓，聚类分析也基本与形态学符合[20]。说明CDDP 标记可应用于蓝莓种质资源的鉴定、遗传多样性等领域的研究。方茜[21]基于SSR 和SSAP标记，鉴定52 份越橘属种质，并对其进行亲缘关系分析，结果表明野生高丛蓝莓参与了兔眼蓝莓的选育。

2.2 种质资源鉴定与指纹图谱构建

随着品种选育、种质交流和引种栽培等工作的推进，难免会出现同物异名或同名异物的现象[5]。这给种质资源的鉴定带来了挑战。基于分子标记对种质资源进行鉴定，并构建指纹图谱可有效解决这些问题。李昱[22]环用ISSR 标记对种质资源进行鉴定，结果表明：9条引物扩增出DNA 谱带54 条，每条引物平均有6 条，其中有35 条为多态条带，平均多态性比率为65%；条带大小介于200～2000bp 之间。谌月[23]运用ISSR 标记研究变异材料，ISSR-PCR 扩增结果发现，变异株和对照相比，存在特异性条。变异材料“A1”“A2”和“A3”与对照材料“V3”的DICE 系数分别为0.800、0.711 和0.722；变异材料“L1”和“L2”与对照“Legacy”的DICE系数分别为0.800 和0.767；变异材料“B1”、“B2”和“B3”与对照“南好”的DICE 则为：0.633、0.589 和0.578。郑姗等[24]利用ISSR 研究17 个蓝莓品种，结果表明：17 个蓝莓品种的遗传相似系数为0.66～0.86，在0.69 的水平可分为4 个品种群；基于UBC825 和UBC862 引物，初步构建了指纹图谱。该图谱可以将供试的材料区分开，为蓝莓品种的鉴定提供技术支持。这表明ISSR 分子标记可以用于蓝莓的种质资源鉴定和突变体筛选。徐国辉等[25]基于EST-SSR 标记研究8 个自然杂交蓝莓优良品系，结果表明：10 对引物组合共检测出23 个等位基因，平均为2.3 个，Shannon 多样性指数均值为0.7003；基于CA94 和CA23 引物构建了供试材料的DNA 指纹图谱。高雄梅等[26]从40 对EST-SSR 引物中筛选多态性良好的引物组合，分析蓝莓的品种。结果表明：10 对引物共扩增出206 个位点，其中多态性位点203 个，占98.12%。每条引物的多态性位点数为9～48 个，平均每条引物扩增出20.6 个位点，平均多态性位点为20.3 个。同时，构建了30 个北高丛蓝莓栽培品种的指纹图谱，在遗传相似系数为0.52 时，30 个品种聚为1 类，当遗传相似系数为0.63时，77.7%的品种仍聚为1 类。郭照东等[27]利用SSR 标记研究越橘22 份栽培品种的遗传背景，结果表明：核心引物NA961 和NA1040 组合构建了22 个越橘品种的指纹图谱，并能够完全区分22 个越橘品种。这为蓝莓种质资源的评价、鉴定、管理及蓝莓新品种的培育奠定了基础，也为分子辅助育种和保护该优良品系提供科学依据[28]。

3 展望

我国蓝莓的分子生物学研究取得了一定的进展，但仍然滞后于其他园艺作物。在后续的研究中，应该加大研究力度。笔者认为，在未来的研究中，可以加强这几方面的研究。一是加强功能性标记，如SCoT、SRAP标记在蓝莓中的应用；二是加强种质的鉴定与指纹图谱的构建；三是构建蓝莓的分子遗传连锁图谱。四是加强功能基因的定位、克隆，推进分子辅助育种。