蒙药制剂乌力吉-18微生物限度检查方法适用性试验

杜美娜 刘建明 刘杨

摘要：目的：建立蒙药制剂乌力吉-18的微生物限度检验方法。方法：按《中国药典》2015年版四部非无菌产品微生物限度检查法：控制菌检查法进行适用性试验。结果：供试品5种试验菌回收比在0.5～2之间，控制菌均能正常检出。

关键词：乌力吉-18;微生物限度;适用性试验

本文参考相关文献，根据蒙药制剂中成分的抑菌作用强度不同，采用了平皿法建立乌力吉-18相应的微生物限度检查方法，经方法适用性试验证实该方法简易有效。

一、实验材料

1.样品名称

乌力吉-18，批号：20180502、20181018、20190410，具由新疆维吾尔自治区博尔塔拉蒙古自治州蒙医医院生产。

2.菌种

枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、沙门氏菌[CMCC（B）50094]以上培养基和菌种均由中国食品药品检定研究院提供工作菌株为第3代。

二、菌液及供试液制备

1.菌液制备

取经35℃培养18-24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于10000cfu/ml的菌悬液;取经35℃培养18-24小时的大肠艾希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌胰酪大豆胨液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于100cfu/ml的菌悬液;取经25℃培养2-3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于10000cfu/ml的菌悬液;取经25℃培养5-7天黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于10000cfu/ml的孢子悬液。

2.供试液制备

取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，制成1：10的供试液;取1：10的供试液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至50ml，制成1：50的供试液。

三、需氧菌总数和霉菌及酵母菌总数计数检查方法适用性

供试液分别加入上述5种代表性实验菌株，再加15-20ml规定的琼脂培养基待凝固后，置规定温度培养24-72小时，观察结果，平板计数，测定回收比值。

试验组：取上述1：10供试液10ml加入0.1ml试验菌，混匀，取含菌供试液1ml分别注入无菌平皿中，立即相应的琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。需氧菌总数计数的试验菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌，相应的琼脂培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基;霉菌和酵母菌总数计数的试验菌株为沙氏葡萄糖琼脂培养基。供试品对照组：取制备好的供试液，不加菌液，按试验组计数方法，测定供试品本底菌数。菌液对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行测定其菌数。结果如下：

四、控制菌检查方法适用性

1.适用性试验

大肠艾希氏菌，取1：10的供试液10ml，加入大肠埃希菌菌液1ml，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基，混匀，置35℃培养18小时，取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上35℃培养18小时，麦康凯琼脂培养基应能检出大肠艾希氏菌反应特征。

耐胆盐革兰阴性菌，取样品1：10供试液100ml，置25℃培养2小时，取上述培养物10ml，加大肠埃希菌菌液、铜绿假单胞菌菌液各1ml，摇匀，接种至100ml肠道菌增菌液体培养基中，35℃培养24小时后，分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，35℃培养18小时，紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上应能检出耐胆盐革兰阴性菌的反应特征。

沙门氏菌，取供试品10g，加入200ml胰酪大豆胨液体培养基，沙门氏菌菌液1ml混匀，35℃培养24小时。取的上述培养物1ml，接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中。35℃培养18小时，取少量RV沙门氏菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，35℃培养18小时，木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应能检出沙门氏菌的反应特征。

2.上述结果表明

本品的控制菌检查方法为：大肠艾希氏菌，取样品1：10供试液10ml接种至胰酪大豆胨液体培养基中，培养基用量100ml;耐胆盐革兰阴性菌，取25℃培养2小时样品1：10供试液10ml，接种至肠道菌增菌液体培养基，培养基用量100ml。

五、结论

按《中國药典》2015年版四部微生物限度检查法、控制菌检查法进行三次独立适用性试验，5种试验菌回收比在0.5～2之间，控制菌均能正常检出。

参考文献：

[1]中国药典通则四部[M].北京：医药卫生出版社.

[2]蒙药乌力吉-18丸的药理与临床研究概况[J].内蒙古民族大学学报（自然科学版）.

课题名称：论文来自课题《博州蒙药制剂微生物限度检验方法的研究》