葡萄籽原花青素对生长猪生长性能、结肠形态和微生物的影响

2020-12-21孙晓江闫慧诗张俊兰郝瑞荣

中国畜牧杂志 2020年12期

孙晓江，闫慧诗，张俊兰，郝瑞荣,2*

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2.山西省优势肉用家畜高效安全生产协同创新中心，山西太谷 030801）

肠道功能影响着动物的健康生长，肠道形态以及肠道微生物是肠道功能的重要影响因素。大量的体内和体外研究表明，正常的肠道菌群是对致病性微生物非常有效的屏障[1]。肠道微生物在肠道免疫系统的发育、免疫调节[2]、代谢调控以及控制代谢紊乱[3]等方面发挥关键作用，而肠道菌群的结构受到宿主基因型、年龄、周围环境、食物以及抗生素等多种因素影响[4]。食物作为肠道微生物直接接触的环境以及营养来源，对肠道微生物的组成具有重要调节作用。近年来，随着动物福利以及人们对畜产品安全的要求，通过饲料改善畜禽的肠道功能已成为研究热点。葡萄籽原花青素（Grape Seed Proanthocyanidins，GSPs）是一种天然多酚，因其强大的抗氧化能力和无毒副作用成为备受瞩目的饲料添加剂之一[5-6]。原花青素是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成，在植物果实中广泛存在，尤其在肉桂粉、干葡萄籽和高粱麸皮中含量丰富[7]。

目前，已经证实GSPs 可以有效地减少仔猪腹泻，增强免疫力，抑制炎症因子的产生，提高抗氧化能力[8-9]。大多数原花青素可完好无损地到达结肠，并被结肠微生物区系降解[10]。因此，推测GSPs 可能通过改变结肠的菌群结构和肠道形态来改善肠道健康状态，而目前这方面研究较少。本试验旨在研究GSPs 对生长猪结肠形态和微生物的影响，为GSPs 的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料葡萄籽原花青素（GSPs）（95% 纯度）由天津尖峰天然产物研究开发有限公司提供，含79.28%的低聚原花青素。

1.2 试验设计选取48 头（60 日龄）平均体重为25.17 kg的杜× 长× 大三元杂交猪。按照单因素完全随机设计分为4 个组。每组3 个重复，每个重复4 头猪。对照组饲喂玉米-豆粕基础日粮，GSPs 组在基础日粮中分别添加100、150、200 mg/kg GSPs。基础日粮参照NRC（2012）生长猪营养需要配制，日粮组成和营养成分见表1。预试期7 d，试验期28 d。猪自由采食和饮水。按猪场常规管理程序进行驱虫和免疫。

表1 基础日粮组成和营养成分

1.3 生长性能测定在试验开始和结束早上空腹称重，每天记录采食量，计算平均日增重、平均日采食量和耗料增重比。

1.4 样品收集与处理在第28 天试验结束时，每个重复屠宰1 头猪，截取结肠，收集其内容物于2.5 mL 已灭菌的冻存管中，迅速置于液氮中，储存于-80℃冰箱中，用于16S rDNA 高通量测序。再截取2 段结肠，一段用1%胰蛋白溶液充分清洗，于2.5%戊二醛中固定，4℃保存，用于扫描电镜观察。另一段用冰冷生理盐水冲洗干净，再放入 4%多聚甲醛中固定，用于光学显微镜下组织形态学观察。

1.5 肠道菌群测定肠道内容物基因组DNA 提取后，扩增16S rDNA 的V3+V4 区。引物序列为341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'、806R：5'-GGACTA CHVGGGTATCTAAT-3'。后将PCR 扩增产物切胶回收，用QuantiFluorTM 荧光计进行定量。将扩增产物纯化后等量混合，连接测序接头，构建测序文库，于Hiseq2500 PE250 上机测序。

1.6 肠道组织形态扫描电镜观察和光学显微镜观察将固定于2.5%戊二醛中的结肠样品经过冲洗、脱水、干燥、粘样、镀膜等处理后进行扫描电镜观察。将固定于4% 多聚甲醛中的结肠经过石蜡切片、HE 染色后，通过ImageJ 软件测量其黏膜厚度。

1.7 数据处理及统计分析测序得到原始数据后通过数据过滤、Tags 拼接、Tags 过滤、Tags 去嵌合体最终获得effective tags，以97% 的一致性将序列聚类成为OTUs。之后进行OTUs 聚类分析，物种分类分析，Alpha 多样性分析，Beta 多样性分析。Bete 多样性PCoA 的统计分析采用Anosim 分析法，R 值表示组间与组内比较的差异程度，一般介于0～1，R＞0 说明组间存在差异，一般R＞0.75 表示大差异，R＞0.5 表示中等差异，R＞0.25 表示小差异，R 等于0 或在0 附近说明组间没有差异。统计分析的可信度用P值表示，P＜0.05表示统计具有显著性。Tax4Fun 微生物功能预测分析，根据OTU 的物种注释和丰度信息，使用Tax4Fun 软件进行KEGG 通路的功能注释，并统计每个KEGG 通路的丰度信息。通过SPSS22.0 软件采用单因素方差分析（One-Way ANOVO）和邓肯（Duncan´s）多重比较，结果以平均值± 标准差表示，P＜0.05 表示差异显著。使用 GraphPad Prism 7 软件作图。

2 结果

2.1 GSPs 对生长猪生长性能的影响由表2 可知，在日粮添加GSPs 对生长猪平均日增重、平均日采食量和耗料增重比无显著影响。

2.2 GSPs 对生长猪结肠黏膜厚度的影响由图1 可知，3 个GSPs 组的结肠黏膜厚度均较对照组显著增加，尤其200 mg/kg GSPs 组差异极显著。

2.3 GSPs 对生长猪结肠形态的影响由图2 可知，对照组黏膜上皮微绒毛不发达，只能在肠腺开口于肠腔处观测到。100 mg/kg GSPs 组变化较小，但在150 mg/kg GSPs 组和200 mg/kg GSPs 组微绒毛明显增多并形成类似细胞衣结构。图中不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05）。图5 同。

表2 日粮添加GSPs 对生长猪生长性能的影响

图1 GSPs 对生长猪结肠黏膜厚度的影响

图2 GSPs 对生长猪结肠形态的影响

2.4 结肠微生物OTUs 和Tags 测序数据由表3 可知，日粮添加GSPs 对生长猪结肠微生物Total tags（Effective Tags 的数量）和Taxon tags（有物种注释的Tags 的数量）无显著影响；OTUs 随着GSPs 添加剂量的增加而显著降低。

2.3 结肠微生物Alpha 多样性指数统计 chao1 多样性估算指数是根据所测得的 tags 数和 OTUs 数量以及相对比例来预测样品中微生物的种类，是基于已知结果所得的相对值。Good’s Coverage 反映样本的低丰度OTUs 覆盖情况。Simpson 指数越接近于 1，则表示该样品中的物种越丰富。由表4 可知，Good’s Coverage 数值已高于0.996，表明测序深度已足够，覆盖良好。200 mg/kg GSPs 组的chao1 多样性指数和Simpson 指数都较对照组显著降低。

2.5 结肠微生物Bete 多样性PCoA 的统计分析基于样本间OTUs 的unweighted Unifrac 分析数据结果，绘制成PCoA 图形并在图上显示Anosim 分析结果。PCoA主坐标分析是一种展示样本间相似性的分析方式，结果更集中于体现样本间的相异性距离，样品越相似，反映在PCoA 图中的距离越近。如图3 所示，150 mg/kg GSPs 组与对照组距离较近，而100 mg/kg GSPs 组和200 mg/kg GSPs 组均距离较远，Anosim 分析结果为R=1（P=0.001）。R 值表示组间与组内比较的差异程度，R 值越大，差异越大，说明在结肠微生物Bete 多样性组间差异均极显著高于组内差异，表明在生长猪日粮中添加100、150、200 mg/kg GSPs 均改变了结肠菌群结构。

2.6 GSPs 对生长猪结肠微生物群落结构由表5 可知，猪结肠优势菌群为拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）。100、150 mg/kg GSPs 组拟杆菌门的丰度均较对照组显著升高，而200 mg/kg GSPs 组结肠拟杆菌门的丰度较对照组显著降低，而厚壁菌门与之相反。200 mg/kg GSPs 组螺旋菌门（Spirochaetae）丰度均显著高于对照组。

从图4 中可以看出，微生物在不同组间菌属构成存在显著差异。拟杆菌门的普雷沃氏菌科NK3B31 群（Prevotellaceae_NK3B31_group）平均丰度在100 mg/kg（22.02%）和150 mg/kg GSPs（11.57%）组均较对照组（6.03%）显著升高，在200 mg/kg GSPs（1.20%）组显著降低。克里斯滕森菌科-R-7（Christensenellaceae_R-7_group）在150 mg/kg GSPs（1.89%）和200 mg/kg GSPs（19.61%）均较对照组（0.80%）显著增加。瘤胃菌科 UCG-002（Ruminococcaceae_UCG-002）随着GSPs 的增加显著递增。密螺旋体科-2（Treponema_2）和拟杆菌属（Bacteroides）在200 mg/kg GSPs（8.90%、2.56%）均较对照组（1.24%、0.80%）显著上升。乳杆菌属（Lactobacillus）在3 个试验组中（1.24%、0.32%、0.03%）均较对照组（9.52%）显著降低。

表3 日粮添加GSPs 对生长猪结肠微生物OTUs 和Tags 数量的影响

表4 日粮添加GSPs 对生长猪结肠微生物Alpha 多样性指数的影响

图3 结肠微生物PCoA 分析

表5 日粮添加GSPs 对生长猪结肠微生物门水平丰度的影响

2.7 结肠微生物免疫功能Tax4Fun 预测分析日粮添加GSPs 生长猪结肠微生物免疫功能显著影响的3 条KEGG 通路。由图5-A 可知，试验组抗原处理和呈递（Antigen processing and presentation）均显著增加。由图5-B、5-C 可知，200 mg/kg GSPs 组NOD 样受体信号通路（NOD-like Receptor Signaling Pathway）和FcγR介导吞噬作用（Fc gamma R-mediated Phagocytosis）均显著下降。

图4 结肠物种属水平分类热图

3 讨论

GSPs 是一种黄酮类多酚物质，以其超强的抗氧化能力和抗炎症能力为人们所熟知。课题组前期研究表明，GSPs 可增强猪的抗氧化能力，提高免疫力，降低腹泻率[8]。同时值得注意的是GSPs 与大分子有机物结合成的复合物在小肠的降解率很低，绝大多数进入结肠，被结肠微生物降解[10]。因此，课题组推测GSPs 对于结肠形态和微生物具有不容忽视的影响。

图5 结肠菌群KEGG 免疫通路的差异分析

通过扫描电镜可见，随着生长猪日粮中GSPs 含量的增加，结肠的肠道形态有明显的改变，微绒毛以肠腺为中心向四周扩展，并形成类似于细胞衣结构，有的甚至将肠腺表面覆盖。尤其在200 mg/kg GSPs 组改变最为明显，黏膜上皮含有类似于微绒毛细胞衣以及连接复合体结构。细胞衣常见于小肠黏膜表面，形成于吸收细胞表面微绒毛，其内含有双糖酶、肽酶，促进糖类和蛋白质的吸收。连接复合体具有屏障作用，阻止肠腔内物质进入深部组织。而在本研究中出现的结构是否为细胞衣以及连接复合体的功能还有待于进一步探究。有研究表明，在体外以400 mg/L 葡萄籽提取物培养肠Caco-2细胞，当细胞处于融合时，蛋白质含量比对照组细胞高，刷状缘更发达，微绒毛更高更密[11]。而结肠黏膜厚度结果与扫描电镜观察结果一致，3 个GSPs 组黏膜厚度均显著增加，以200 mg/kg GSPs 组最高。因此，葡萄籽多酚对于改善肠道结构、促进肠绒毛增生具有积极作用，其可能的原因是类黄酮与肠道刷状缘酶之间相互作用的结果[12]。

原花青素对于细菌具有抑制作用，而本研究也发现随着饲料中GSPs 添加量的增加，OTUs 显著降低。不同菌属对不同剂量的GSPs 的适应力不同，聚合原花亲素被肠道微生物代谢成各种酚酸，包括苯丙酸、苯乙酸和苯戊酸[13]，这些代谢物以及肠道菌群之间的相互竞争都对肠道菌群的生长具有调节作用。肠道菌群改变也将会导致肠道功能发生改变。

普雷沃氏菌属的成员曾被描述为活性果胶降解体[14]，代谢产生琥珀酸盐和乙酸盐。研究证明某些普雷沃氏菌科对难吸收的多糖类具有降解作用[15]，密螺旋体属通常分布于动物胃肠道中，编码多种碳水化合物活性酶[16]，同时也是果胶降解菌属，生成乙酸盐[17]。而在本研究中，200 mg/kg GSPs 组中普雷沃氏菌科NK3B31 群显著下降，而密螺旋体科-2 显著上升，两者是否存在竞争关系，有待于进一步研究。研究表明，在高饲料转化率的猪回肠中克里斯滕森菌科-R-7 为优势菌属[18]，其代谢产物有次黄嘌呤、鸟嘌呤、对苯二酚、葡萄糖、瓜氨酸、胆碱和5-羟基吲哚-3-乙酸[19]，还可以产生短链脂肪酸（SCFAs）[20]。本研究中，克里斯滕森菌科-R-7 在200 mg/kg GSPs 组显著增加。瘤胃菌科成员可以降解宿主不能消化的纤维素和半纤维素产生SCFAs[21]，SCFAs 是上皮和机体组织的重要营养物质[22]，在日粮中添加葡萄籽提取物的杂交母猪粪便中发现瘤胃菌科显著增加[23]，这与本研究中瘤胃菌科UCG-002 与GSPs 添加量呈正相关结果相一致。乳杆菌属被GSPs 显著抑制，这与在小鼠高脂饮食添加GSPs 发现的趋势一致[24]。乳杆菌属通常被当作益生菌属，但乳酸菌科减少可能会减少能量的损失，因为乳酸菌提高了微生物胆汁盐水解酶的活性，胆汁盐水解酶的作用主要是水解小肠胆汁盐和食物共沉淀后的胆固醇，因而削弱了宿主对脂质的吸收[25]。拟杆菌属产生的多糖和丁酸盐能够促进健康的肠道免疫[26-27]。本研究中，200 mg/kg GSPs 组拟杆菌属显著升高。本研究根据菌群Tax4Fun 功能预测发现GSPs 可以提高结道菌群抗原处理和呈递能力，添加200 mg/kg GSPs 可以降低NOD 样受体信号通路和FcγR 介导吞噬作用触发的炎症反应。研究发现GSPs 能够抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的ERK1/2、JNK 和p38 蛋白的磷酸化抑制MAPK 通路的激活，同时通过抑制IκBα和IKKα的降解抑制NF-κB/p65 的活化[28]，进而降低炎症反应，改善细胞生存环境。由于当时条件有限，本研究中重复数较少，每组屠宰了3 头猪。重复数越多，结果越可靠，之后开展试验时重复数至少要6～8 头。