新生儿缺氧缺血性脑病血清miR-15b、miR-424表达水平及其临床意义

张晋雷，薄延桥

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischenic encephalopathy，HIE)是由于新生儿在围生期窒息缺氧，导致脑部缺氧造成的一系列脑损伤[1]，是新生儿脑病中最常见的疾病之一。HIE患儿大部分都有宫内窘迫史，病情严重时可造成新生儿早期死亡、不可逆转的脑损伤和不同程度后遗症等，是导致儿童神经系统伤残的常见病因[2]。研究发现，miRNA在体内稳定存在，不参与转录翻译，适合作为疾病早期诊断的追踪观测对象[3]。谢时帅等[4]研究发现，miRNA与中枢神经的发育有关，并在神经系统疾病的发生发展中起重要作用。已有研究表明，miR-424在血管性疾病、中枢神经系统疾病中发挥重要作用[5]，但是对于这两种微小RNA是否与HIE有关以及其在HIE中表达趋势的相关研究较少。因此，本研究从检测miR-15b、miR-424在HIE患儿血清中表达水平入手，探究其与HIE发生、发展和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年4月—2017年4月我院儿科收治的68例HIE患儿为试验组，其中男35例，女33例；胎龄36～42(39.87±1.96)周；体重2.71～4.02(3.69±0.41)kg。根据患儿临床HIE分度标准[6-7]分为轻度组、中度组和重度组，其中轻度组24例，中度组28例，重度组16例。纳入标准：①符合HIE诊断标准[6]，确诊为新生儿缺氧缺血性脑病；②无宫内感染及先天遗传性疾病；③临床及随访资料完整。排除标准：①先天发育畸形；②孕妇妊娠期间有各种急慢性感染及宫内感染史，严重肝、肾功能不全，恶性肿瘤，自身免疫性疾病，恶性心律失常，产后7 d内出现产后并发症；③产伤性颅内出血。同时选取我院68名同期分娩的健康婴儿为对照组，其中男37名，女31名；胎龄38～41(40.15±0.89)周；体重2.89～3.87(3.61±0.32)kg。两组性别、胎龄、出生体重等比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。详见表1。本研究经我院伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得受试新生儿家长知情同意并签字，符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》。

表1 两组临床资料比较

1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司，批号：DP443)；miScript SYBR®Green Mix试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，批号Q221-01)；引物由上海生工生物公司设计合成；qRT-PCR仪(美国Bio-Rad公司生产，型号CFX96)。

1.3 方法

1.3.1 样品采集及保存 入选新生儿均于出生后48 h内抽取股静脉血3 mL置于红色采血管中，3 000 r/min，4 ℃条件下离心10 min后，取上清液分装于EP管中，-80 ℃保存备用。

1.3.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-15b、miR-424表达水平 采用qRT-PCR检测HIE患儿和健康新生儿血清中miR-15b、miR-424水平。采用RNA提取试剂盒提取HIE患儿血清总RNA，反转录得到cDNA。采用定量PCR仪对miR-15b和miRNA-424进行扩增。qRT-PCR反应体系共10 μL：miScript SYBR®Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，双蒸水(dd H2O)3.0 μL。反应条件为95 ℃、90 s，95 ℃、30 s，63 ℃、30 s，72 ℃、15 s，40个循环。采用2-△△CT法对miR-15b、miR-424表达水平进行定量分析。引物序列见表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.3.3 新生儿神经行为测量(Neonatal Behavioral Neurological Assessment，NBNA)评分测定 试验组HIE患儿在出生后28 d测定NBNA评分[8]。NBNA评分包括6项行为能力评分、4项被动肌张力评分、4项主动肌张力评分、3项原始反射评分及3项一般状态评分。每项评分分值为0～2分，总分40分，>37分表示神经功能正常，35～37分为临界异常，<35分为异常。

1.4 随访 所有HIE患儿均接受门诊复诊或电话随访，每3个月随访1次，随访2年，截止时间为2019年5月1日。随访期间无患儿失访。随访期间测定并记录患儿NBNA评分、脑性瘫痪和癫痫发病情况、生存情况。根据随访情况分为预后良好组和预后不良组。预后不良为患儿发生下列其中1项：NBNA评分<35分、脑性瘫痪、癫痫或死亡[9-10]。

2 结 果

2.1 HIE患儿和健康新生儿血清miR-15b、miR-424表达水平比较 HIE患儿血清miR-15b、miR-424表达水平均明显低于健康新生儿(P<0.05)。详见表3。

表3 HIE患儿和健康新生儿血清miR-15b、miR-424表达水平比较(±s)

2.2 不同严重程度HIE患儿血清miR-15b、miR-424表达水平比较 与轻度组比较，重度组、中度组HIE患儿出生后28 d血清miR-15b、miR-424表达水平明显降低(P<0.05)；与中度组比较，重度组HIE患儿出生后28 d血清miR-15b、miR-424表达水平均明显降低(P<0.05)。详见表4。

表4 不同严重程度HIE患儿血清miR-15b、miR-424表达水平比较(±s)

2.3 不同病情严重程度HIE患儿出生后28 d NBNA评分比较 重度组、中度组出生后28 d NBNA评分低于轻度组(P<0.05)。重度组出生后28 d NBNA评分低于中度组(P<0.05)。详见表5。

表5 不同病情严重程度HIE患儿出生后28 d NBNA评分比较(±s) 单位：分

2.4 miR-15b、miR-424表达水平与出生后28 d NBNA评分的相关性分析 相关性分析显示，HIE患儿miR-15b、miR-424表达水平与出生后28 d NBNA评分均呈正相关(r=0.256，P<0.05；r=0.317，P<0.05)。详见表6。

表6 miR-15b、miR-424表达水平与NBNA评分的相关性分析

2.5 血清miR-15b、miR-424表达水平与HIE患儿预后关系 预后良好组HIE患儿血清miR-15b、miR-424高表达率均明显高于预后不良组患儿(P<0.05)。详见表7。

表7 血清miR-15b、miR-424表达水平与HIE患儿预后关系 单位：例(%)

3 讨 论

HIE在新生儿中多见，发病率为活产足月儿的0.3%～0.6%[11]。根据HIE临床分度可将HIE患儿分为轻度、中度、重度。HIE会导致不同程度的后遗症，与患儿后遗症严重程度、预后有关的因素有许多，如临床分度、NBNA评分、介入治疗时间等。造成HIE的原因很多[12]，如围产期宫内窘迫、难产等。在分娩过程中发生窒息经过抢救，并及时采取相应治疗措施后，可控制HIE的发生，但是对于严重窒息的婴儿，HIE发病率依然很高，窒息缺氧直接导致婴儿脑部供血不足，此时脑部区域糖酵解作用大幅度增加[13]，脑细胞氧化代谢受损；同时，脑血管自动调节功能减退，血管周围的细胞病变导致管腔变窄甚至闭塞，脑部形成不可逆性损伤，导致预后不良。因此，探究HIE的发病机制，寻找有效应对措施和治疗方法是目前的研究热点。

miR-15b是miR-15/16家族成员一员[14]，在机体各系统、特别是血管内皮系统广泛表达，主要影响细胞增殖、凋亡、侵袭、成管能力等。已有研究表明，在动物模型和体外实验中，miR-15b与血管形成、细胞凋亡等调节有关[15-16]。黄姿等[17]研究发现不稳定型心绞痛、急性ST段抬高型心肌梗死病人血浆中miR-15b表达水平降低，说明miR-15b与急性冠脉综合征病人冠状动脉病变严重程度有关。Zhu等[14]研究表明miR-15b有抗血管生成的作用。本研究发现HIE患儿血清miR-15b表达相对于对照组下调，说明miR-15b可能与HIE发生有关。麦友刚等[18]在肺成纤维细胞研究中发现，miR-15b过表达可抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达水平，参与支气管发育不良过程。王薇等[19]研究表明，VEGF参与HIE病理生理过程，VEGF可联合突变型低氧诱导因子促进血管新生[20]。本研究发现，HIE患儿血清miR-15b表达水平与HIE患儿28 d NBNA分值呈正相关，提示miR-15b可能反映HIE患儿病程的发展。进一步研究发现，预后良好组HIE患儿血清miR-15b高表达率均明显高于预后不良组患儿，提示miR-15b低表达可能与HIE患儿的不良预后有关。

Chen等[21]研究发现，miR-424可调节缺氧诱导因子表达，减轻小鼠缺血性肾损伤，对缺血性再灌注损伤有保护作用。本研究发现，miR-424在HIE患儿血清中表达水平较对照组明显下降，说明miR-424可能与HIE的发生有关。进一步研究发现，miR-424的表达与HIE患儿分度有关，提示miR-424可能参与HIE病情的发生发展。郜乐乐等[5]在急性脑梗死研究中发现，miR-424在急性脑梗死病人中表达下调，且表达水平与急性脑梗死患病程度有关。本研究发现，miR-424的表达水平随HIE病情严重程度上升而下降，且与HIE患儿出生后28 d NBNA评分呈正相关，说明miR-424可能参与HIE病程的发展。进一步研究发现，与预后良好组相比，预后不良组HIE患儿血清miR-424高表达率明显降低，提示miR-424可能与HIE患儿预后有关。

综上所述，HIE患儿血清中miR-15b、miR-424表达较对照组下调，与临床分度、出生后28 d NBNA评分有关，对预后有影响，可能在HIE的发展过程中发挥一定作用。本研究不足之处为统计样本量不足，后期将增加样本量对miR-15b、miR-424在HIE疾病进展中的作用进行深入研究。