清热活血药对急性脑缺血再灌注大鼠MAPK通路的影响

陈宝鑫，傅 晨，张昕洋，贺立娟，徐榛敏，刘雪梅

急性脑梗死(acute ischemic stroke，AIS)是临床最常见的脑血管疾病，约占全部脑血管病的85%，2018年10月发布的《中国脑卒中防治报告(2018)》[1]指出我国40岁及以上人群的脑卒中患病率由2012年的1.89%上升至2016年的2.19%，现患和曾患人数达1 242万人，每年死于脑卒中的病人高达196万人。炎症反应在急性脑梗死过程中起着关键作用，其不仅参与脑缺血的病理生理过程，而且被认为是引发加重脑损伤的主要因素之一[2]。中医学者大多认可瘀血存在于中风病的全过程，既是重要致病因素，又是病理产物。中风火热论由金元时期刘完素大力倡导，云：“六气之中，火热占二，余风、湿、燥、寒诸气经传变皆能化热生火”“中风偏枯者，由心火暴盛而水衰不能制，则火实克金，金不能平木，则肝木胜，而兼于火热，则卒暴僵仆”。本团队长期从事中医药治疗中风病研究，认为火热与瘀血蕴积是急性脑梗死加重、恶化的主要病因病机。选择苦碟子注射液作为清热活血药的代表药物进行研究，主要成分为腺苷和黄酮类物质，具有活血止痛、清热祛瘀的作用，对急性脑梗死的疗效优于目前常用的其他药物[3]。有Meta分析显示，常规治疗基础上加用苦碟子注射液可以提高急性脑梗死的疗效，明显改善病人神经功能损害程度[4]。本团队前期临床研究证实苦碟子注射液可较早、较显著地降低病人血清白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平，升高白细胞介素-10(IL-10)水平，降低神经元特异性烯醇化酶(NSE)和S100B水平，具有一定的疗效[5]。有实验研究证实，苦碟子注射液可下调大脑中动脉缺血(MCAO)大鼠Toll样受体-4(TLR-4)依赖性核因子-κB(NF-κB)信号通路发挥功能，降低细胞凋亡，保护大脑免受缺血性损伤[6-7]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是细胞内重要的信号传导通路，在脑缺血级联反应损伤过程中起着关键作用。MAPK信号通路主要包括细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38。MAPK信号通路和NF-κB信号通路具有相关性，磷酸化p38(p-p38)和磷酸化ERK(p-ERK)活化后由胞质转位到核内，激活NF-κB，下调p38 MAPK信号通路可抑制NF-κB的过度激活[8]。因此，本研究从NF-κB上游的MAPK通路入手，探讨清热活血药对急性脑梗死的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，无特定病原体(SPF)级，体重(230±20)g，购自维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0006。在北京中医药大学东方医院实验中心饲养，大鼠自由进食、饮水，控制室温在18～26 ℃，相对湿度40%～70%，每日光照时间12 h。

1.2 药物与试剂 苦碟子注射液(通化华夏药业有限责任公司生产，国药准字Z20025450)，RIPA buffer(R0278，sigma)，蛋白酶抑制剂(11697498001，Roche)，BCA蛋白定量试剂盒(23225，Thermo)，LDS Sample Buffer 4×(NP0007，Thermo)，SDS-PAGE预制胶10%(14100312，Thermo)，预染蛋白(LC5925，Life)，电泳缓冲液(NP0001，Thermo)，转膜液(NP0006-1，Thermo)， phopho-p38 MAPK兔多克隆抗体(9211，CST)， p38 MAPK兔多克隆抗体(9212，CST)，phopho-JNK兔多克隆抗体(4668，CST)，JNK兔多克隆抗体(9252，CST)，phopho-ERK兔多克隆抗体(9101，CST)，ERK兔多克隆抗体(9102，CST)，羊抗兔二抗(A11011，Invitrogen)，脱脂奶粉(232100，BD)，ECL超敏发光液(WBKLS0500，Millipore)，IL-6试剂盒(MD120792，MDL)，MMP-9试剂盒(MD120284，MDL)。

1.3 仪器 MCAO栓线(A4-243250，北京西浓科技有限公司)，MultiSkan3酶标仪(Thermo)，垂直电泳系统(121201-0899 Thermo)，转膜系统(153BR6581，Biorad)，凝胶成像分析仪(5000P91DW，Gene)。

1.4 动物模型 采用10%水合氯醛(35 mg/kg)对大鼠进行腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，颈部正中切开，逐层分离组织，暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，永久结扎CCA近心端、ECA根部，微动脉夹暂时夹闭CCA的远心端，在CCA结扎处远心端剪一斜口，经此斜口插入顶端光滑成球面的直径0.24 mm的尼龙线，经CCA分叉处通过ICA入颅至大脑前动脉(ACA)的起始部，从而闭塞大脑中动脉(MCA)的起始部，造成MCA供血相关区的梗死。尼龙线插入深度为(18.5±0.5)mm，结扎CCA远心端以固定尼龙线和防止出血，逐层缝合皮肤，尼龙线末端暴露在体外。栓塞1.5 h后，拔出尼龙线24 h，模拟急性脑缺血再灌注模型。假手术组除插线10 mm外，其余步骤同模型组。采用Zea Longa神经症状评分[8]，选取评分1～3分的大鼠，共39只进入实验。

1.5 分组与给药 实验大鼠随机分为3组：假手术组、模型组(缺血1.5 h再灌注24 h)、清热活血药治疗组，每组13只。清热活血药治疗组给予腹腔注射苦碟子注射液，手术后2 h给药1次，以后每隔12 h给药1次，共给药3次。给药剂量按照体表面积进行换算，dB(mg/kg)=dA×(RB/RA)×(WA/WB)1/3，其中dB是大鼠的千克体重剂量，dA是人的千克体重剂量，WA、WB是已知人和大鼠的体重，RA、RB是体型系数(RA=0.1，RB=0.09)。由此计算出大鼠给予苦碟子注射液3.6 mL/kg(本团队先前发表的文章也证实此剂量安全有效[6-7])，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水。

1.6 神经功能评价 每组取10只大鼠进行神经功能评价。采用Garcia JH评分[9]评价大鼠神经功能，功能正常评分最高，为18分；功能损伤最严重评分最低，为3分。

1.7 脑梗死体积 各组大鼠在MCAO造模后24 h取材，使用10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，迅速断头取脑，-20 ℃冰箱内冷冻10 min，首先去除嗅球和脑干部分，然后自额极开始行2 mm厚连续冠状切片，均匀切成5片。将切片放入5 mL 1%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染液中，37 ℃避光水浴15 min。待显色完全，10%多聚甲醛固定脑片30 min，拍照。采用Image J分析软件对TTC染色照片进行统计分析，脑梗死体积百分比=(各脑切片梗死面积×切片厚度之和)/(各脑切片的面积×切片厚度之和)。每组10只，其中清热活血药治疗组死亡2只。

1.8 蛋白免疫印迹法(Western Blot) 取各组大鼠缺血侧大脑皮层，加适量含有cocktail蛋白酶抑制剂的裂解液提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。余蛋白加入适量样品还原剂、4×上样缓冲液，95 ℃金属浴5 min蛋白变性，-80 ℃保存或直接进行实验。使用SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h。加入用5%脱脂奶粉配制的一抗，p-p38兔多克隆抗体(1∶1 000)，p38兔多克隆抗体(1∶2 000)，磷酸化-JNK(p-JNK)兔多克隆抗体(1∶1 000)，JNK兔多克隆抗体(1∶4 000)，磷酸化p-ERK1/2兔多克隆抗体(1∶2000)，ERK1/2兔多克隆抗体(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，PBST漂洗，5 min×3次，加入二抗，山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)，室温摇床孵育1 h。PBST洗膜，增强化学发光(ECL)显影曝光。每组3只，实验重复3次。Image J软件分析蛋白电泳条带的光密度值。

1.9 酶联免疫吸附实验(ELISA) 取各组大鼠缺血侧大脑皮层，ELISA法检测IL-6、MMP-9。按照试剂盒进行操作。①加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。标准孔7孔，依次加入100 μL不同浓度的标准品。空白孔加100 μL 标准品稀释液，余孔加待测样品100 μL，37 ℃温育1 h，弃液；②各孔加检测工作液A 100 μL，37 ℃温育1 h，弃液，洗板3次；③各孔加检测工作液B 100 μL，37 ℃温育30 min，弃液，洗板3次；④各孔加入TMB底物溶液90 μL，37 ℃避光孵育10～20 min；⑤各孔加终止溶液50 μL，终止反应；⑥酶标仪450 nm波长测量各孔的光密度值(OD值)。

2 结 果

2.1 各组神经功能缺损程度比较 模型组与假手术组神经功能缺损程度比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，清热活血药治疗组神经功能缺损程度改善(P<0.05)。提示清热活血药可以改善MACO大鼠神经功能缺损程度。详见表1。

表1各组大鼠神经功能评分比较

单位：分

2.2 各组脑梗死体积比较 TTC染色发现，模型组和清热活血药治疗组的脑组织可见明显白色梗死灶。与模型组比较，清热活血药治疗组白色梗死区减小，脑梗死体积明显减小(P<0.01)。结果见表2、图1。

表2 各组大鼠脑梗死体积比较(±s) 单位：%

图1 各组大鼠脑组织TTC染色观察脑缺血形态

2.3 各组MAPK蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧大脑皮层中p-p38、p-ERK1/2蛋白表达水平明显增高(P<0.01)；与模型组比较，清热活血药治疗组p-p38、p-ERK1/2的蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，而对JNK蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3、图2。

2.4 各组缺血侧皮层炎性因子表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧大脑皮层中IL-6、MMP-9表达均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，清热活血药组IL-6、MMP-9表达均明显降低(P<0.01)。详见表4。

表3 各组大鼠缺血侧皮层MAPK蛋白表达水平比较

图2 各组缺血侧皮层MAPK及其磷酸化蛋白表达电泳图

表4 各组缺血侧皮层炎性因子表达水平比较(±s)

3 讨 论

脑缺血缺氧激活大量炎症细胞，如小胶质细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞等，炎症细胞产生大量的炎症相关因子，如IL-6、MMP-9，这些因子又会通过相关细胞信号通路对炎症细胞起到反馈调节作用，加剧脑细胞的损伤，并破坏了血脑屏障及细胞外基质，而血脑屏障的破坏引起大脑的二次损伤，放大了瀑布式的炎症级联反应。IL-6是临床和实验研究最多的炎性因子。脑缺血发生后，IL-6水平随着时间推移而增加，脑缺血3 d达高峰，7 d时仍显著增高，甚至持续到缺血14 d。IL-6与病人病情严重程度、中风严重性、梗死体积、不良预后密切相关[10-11]。基质金属蛋白酶(MMPs)攻击血管环绕的细胞外基质，促进神经细胞死亡。在脑缺血的早期阶段，MMP-9破坏血脑屏障，导致渗漏、白细胞浸润、脑水肿甚至出血[12]。MMP-9水平的升高可作为脑卒中死亡和预后不良的预测因子[13]。本实验结果发现，脑缺血大鼠的皮层IL-6、MMP-9明显升高，清热活血药可以降低IL-6、MMP-9水平，这也与本课题组前期研究结果有一致性，前期发现临床急性脑梗死病人入院3～5 d，苦碟子注射液可明显降低血清IL-6和MMP-9水平，至第14天，与基础治疗组比较，仍可明显降低血清MMP-9[5]。

MAPK属于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。主要包括ERK、JNK和p38，其各自介导不同的MAPK信号通路，调节细胞内基因转录，参与细胞增殖、分化、凋亡等生理过程，介导生长发育、炎症反应等生命活动[14-15]。研究发现，在脑梗死早期p38即被激活，在神经元和神经胶质细胞中大量存在。激活后的p38可促进内皮细胞炎性介质和黏附因子的表达，导致血脑屏障的破坏。而产生的炎性介质进一步激活p38，形成正反馈的恶性循环。p-p38是p38信号通路中介导炎症反应的活性物质。Sugino等[16]研究发现蒙古沙鼠全脑缺血后，海马CA1区JNK、p38被激活，大剂量的p38抑制剂SB203580能够适度抑制JNK激活，降低细胞凋亡，提示p38在脑缺血期间的海马神经元存活和死亡中起重要作用。研究发现，脑梗死会引起时间依赖性的ERK激活，应用ERK抑制剂可以有效降低梗死区炎症细胞因子的表达和细胞的死亡，发现ERK信号通路可以通过上调MMP-9蛋白的表达来增加血脑屏障的通透性，加重脑损伤。ERK1/2信号通路可通过MAPK激酶(MEK)激活MMP-9，加剧血脑屏障的损伤，从而加重炎症反应[17]。本研究结果发现，清热活血药能够降低磷酸化的p38、ERK蛋白表达，降低IL-6、MMP-9的表达，说明其可能是通过抑制MAPK蛋白表达，进而降低炎症反应相关因子IL-6、MMP-9的表达，从而发挥对脑梗死的调节作用。

本课题组认为缺血性中风病病人素体阴虚、复感外邪，致气机不畅、血失气煦、内生瘀血；邪从热化，蕴积化生火热，火热内炽，邪热内陷，煎熬津液，燔灼阴血，生痰生瘀，加重阴虚之候，上述过程相互诱导、促进、加重、恶化，是中风病急性期的重要病因和基本病机。瘀血是中风病急性期的始动病因和病理产物，火热是进展恶化的重要因素，二者相兼致病，难治难愈。因此，火热与瘀血蕴积可能是急性脑梗死加重恶化的主要病因病机。本研究发现清热活血药对MAPK信号通路的调节作用主要针对p38和ERK1/2的磷酸化，进而影响其下游的炎症相关因子的表达。另一方面，从结果中可以发现清热活血药对MAPK信号通路的调节具有选择性，具有多靶点调控的特点，而其发挥调节作用的关键蛋白p38和ERK1/2将有可能成为脑梗死治疗的潜在的靶环节。