水产动物源细菌质粒介导的喹诺酮类耐药研究概况

吴甘林，邓玉婷，姜 兰，谭爱萍，赵 飞，张瑞泉

( 1.中国水产科学研究院 珠江水产研究所，农业农村部渔用药物创制重点实验室，广东省免疫技术重点实验室，广东 广州 510380； 2.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306； 3.农业部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141 )

喹诺酮类药物是一种人工合成的抗菌药物，这类抗菌药都有喹诺酮环结构，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类。喹诺酮类药物能够穿透细胞壁进入细胞直接作用于DNA促旋酶(拓扑异构酶Ⅱ)和拓扑异构酶Ⅳ[1]，通过抑制这两种酶而阻断DNA的复制，从而发挥抗菌作用[2]。由于这类药物拥有抗菌谱广、高效、用药量低、给药方便、毒副作用低和与其他抗菌药物不产生交叉耐药等优点[3]，广泛应用于人医临床、畜牧水产养殖的细菌病治疗中。目前喹诺酮类药物主要用于治疗水产养殖动物常见病原如气单胞菌(Aeromonas)、弧菌(Vibrio)等引起的细菌性疾病[4]。其中第三代氟喹诺酮类药物恩诺沙星是我国水产批准使用的动物专用药物[5]，由于其在水产动物体内的半衰期长、分布广、吸收好及广谱抗菌等特性而被广泛应用于水产养殖动物感染性疾病的预防和治疗[6]。另外，诺氟沙星也是水产养殖上广泛使用的药物之一[6]，除了单方给药外，常与盐酸小檗碱成复方预混剂使用[5]。由于氟喹诺酮类药物在畜牧水产养殖的广泛应用，耐药性问题也越趋严重，为了减少该类药物可能对养殖业、人体健康造成危害或者潜在风险，农业部自2016年开始禁止将洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和诺氟沙星4种氟喹诺酮类药物用于食品动物养殖[7]。

近年来，随着喹诺酮类药物长期、大量、广泛使用，导致人类、动物及环境细菌喹诺酮类耐药性不断增强[8]。细菌对喹诺酮类药物的耐药机理主要有基因突变、膜对药物的通透性改变、外排泵及质粒介导的喹诺酮类耐药[1]。基因突变主要是改变药物的作用靶位，突变发生后药物丢失作用靶位而产生耐药[9]。膜通透性改变及外排泵的存在可以使细胞质内的药物含量下降，药物的抗菌活性便会降低[10]。在质粒介导的喹诺酮类耐药被发现之前人们一直认为细菌对喹诺酮类药物耐药主要由染色体上的靶基因突变和细胞膜通透性改变所致，而近年来科学家们陆续发现了各种质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)机制。由于质粒介导的喹诺酮类耐药基因大多位于可移动接合质粒上，可通过整合子、转座子、插入序列等耐药元件进行耐药基因交换，从而加快喹诺酮类耐药性在细菌之间的传播。

随着水产动物源细菌喹诺酮类耐药性的日益严重，因此有必要开展水产动物源细菌喹诺酮类耐药性的调查和加强质粒介导的喹诺酮类耐药基因分子传播机制研究，为减少喹诺酮类耐药菌的产生和传播提供理论依据。笔者将从质粒介导的喹诺酮类耐药机制、水产动物源细菌对喹诺酮类药物耐药状况及质粒介导的喹诺酮类耐药基因的流行分布等方面进行综述，以期引起人们对水产养殖中细菌耐药性的重视，也为科研工作者对水产养殖中细菌对喹诺酮类药物耐药性的产生、流行及其传播途径的研究提供一定的研究思路。

1 质粒介导喹诺酮类耐药机制

质粒介导的喹诺酮类耐药基因一般分为三大类，第一类是qnr基因及其不同的等位基因，包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qnrVC基因，第二类是能降低环丙沙星活性的氨基糖苷乙酰转移酶变异基因aac(6′)-Ib-cr，第三类是外排泵基因qepA和oqxAB[11]。

1.1 qnr基因

qnr基因在1998年由美国学者Martínez等[12]首次报道，该基因发现于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)的一个耐药质粒pMG252上。qnr基因编码五肽重复氨基酸序列五肽重复家族Qnr蛋白，由于后续发现新的变体，qnr被重新命名为qnrA和qnrA1，后续又有qnrB、qnrS、qnrC和qnrD等一系列质粒介导的喹诺酮耐药基因的报道。最近，一种新的qnr家族——qnrVC基因也陆续被报道，qnrVC基因最早在霍乱弧菌(Vibriocholerae)中检出[13]，主要在海产品、水环境及腹泻病人分离的弧菌中流行[14-16]，Qnr蛋白的作用机制是通过保护DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ不受药物的抑制，避免促旋酶、喹诺酮类药物和DNA三者形成稳定的复合物，进而导致喹诺酮类药物失效[17-18]。Martínez等[12]发现，携带了qnr基因质粒的菌株其染色体自发突变的频率增加了100倍，表明携带了qnr基因的质粒可以促进菌株染色体突变从而导致高水平喹诺酮类耐药的产生。

1.2 aac(6′)-Ib-cr基因

2006年，美国学者Robicsek等[19]发现，氨基糖苷乙酰转移酶Aac(6′)-Ib发生了两处氨基酸的突变，即Trp102Arg和Asp179Tyr，该突变引起大肠杆菌(Escherichiacoli)对环丙沙星的敏感性下降，因此将该突变体命名为Aac(6′)-Ib-cr，其中“-cr”表示环丙沙星耐药。aac(6′)-Ib-cr基因编码的灭活酶其作用位点是哌嗪环上的氨基氮“NH”，所以只乙酰化喹诺酮类药物中含有哌嗪环的环丙沙星和诺氟沙星，从而降低细菌对该药物的敏感性[20]。据报道，aac(6′)-Ib-cr基因多位于多重耐药质粒的整合子上，少量位于染色体上，因此也将其归为质粒介导的喹诺酮类耐药机制[12]；aac(6′)-Ib-cr单独存在时引起细菌对环丙沙星的最小抑菌浓度增加了3～4倍，比qnr基因介导的低，且对萘啶酸、左氧氟沙星等哌嗪环上的氨基已被甲基取代的喹诺酮类药物不起作用[19]。由于该基因编码的灭活酶可以同时介导氨基糖苷类和喹诺酮类耐药，体现了细菌在抗菌药物选择压力下的强适应能力[11]。

1.3 qepA基因

喹诺酮类外排泵(qepA)是日本学者Yamane等[21]在2002年自住院病人尿液分离的大肠杆菌中发现的。qepA由14个跨膜区511个氨基酸组成，是一种质子依赖型的外排泵蛋白，类似于环境放线菌的主要易化超家族(MFS)，可以降低对亲水性氟喹诺酮类药物如环丙沙星、诺氟沙星的敏感性。qepA基因检出的报道较少，主要见于肠杆菌科，如大肠杆菌，也有在其他革兰氏阴性菌上发现[11]。研究表明，IS26和ISCR3C耐药元件有助于质粒上的qepA基因的传播[11]。

1.4 oqxAB基因

oqxAB作为一种多重药物外排泵，属于耐药结节分化超家族(RND)外排泵，最初与用于猪的促生长剂喹乙醇有关[22]。oqxAB基因具有广泛的底物特异性，仅对氯霉素、甲氧苄啶、环丙沙星、诺氟沙星及萘啶酸具有敏感性[22]。由于它可以降低细菌对喹诺酮类药物的敏感性，且多位于耐药质粒上，后被归入质粒介导的喹诺酮类耐药机制家族[23]。oqxAB基因也主要在革兰氏阴性菌检出，广泛存在于大肠杆菌中，尤其是动物源肠杆菌科细菌检出率较高[24]。oqxAB基因两端通常都含有IS26-like序列，该元件促进了oqxAB基因在菌株中的广泛传播[24]。

2 我国水产动物源细菌对喹诺酮类药物耐药状况

目前虽然只认为质粒介导的喹诺酮类耐药基因只引起低水平耐药(菌株对喹诺酮类药物的敏感性下降，但最小抑菌浓度值未达到耐药折点)，但质粒介导的喹诺酮类耐药基因的存在可促进其他喹诺酮类耐药机制如靶位基因突变、外排机制的发生，有助于菌株产生喹诺酮类药物高水平耐药(其最小抑菌浓度值高于耐药折点)[23]。随着喹诺酮类药物在水产养殖中的大量使用，水产动物源细菌不可避免地产生了喹诺酮类耐药。喹诺酮类耐药菌的出现范围正在扩大，世界各地均不同程度地分离到相关耐药菌。目前，国内外学者已在各种水产动物病原菌如气单胞菌、弧菌、链球菌(Streptococcus)、爱德华氏菌(Edwardsiella)，水产品食源性细菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)等中检测到喹诺酮类耐药。

关于喹诺酮类药物的耐药研究显示，不同科属细菌对各种喹诺酮类药物的耐药情况各有差异，不同地域、不同养殖品种对于喹诺酮药类物耐药情况也有不同。研究发现，在患病水产动物上分离的病原菌对氟喹诺酮类的耐药率为5%～80%，不同科属的病原菌耐药率差异较大。吕小丽等[25]采用纸片扩散法对分离自广西地区发病尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的30株无乳链球菌(S.agalactiae)进行药物敏感性测定，结果显示，分离菌株对不同喹诺酮类药物的耐药率差异较大，对依诺沙星的耐药率最高，为80%，对诺氟沙星的耐药率也达到40%，而对环丙沙星、氧氟沙星和左氟沙星的耐药率均低于10%，对恩诺沙星和盐酸沙拉沙星完全敏感。丁正峰等[26]于2006—2009年期间收集江苏省境内480株水产病原菌进行菌种鉴定及耐药率统计，其中弗尼斯弧菌(V.furniss)对4种氟喹诺酮类药物(诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星)的耐药率为20%～50%，嗜水气单胞菌(A.hydrophila)为45%～70%，类志贺邻单胞菌(Plesimonasshigelloides)为65%～85%。林居纯等[27]采用纸片扩散法对分离自不同患病水产动物体内的120株嗜水气单胞菌进行药物敏感性测定，结果显示，对诺氟沙星、环丙沙星和氧氟沙星的耐药率分别为55%、40%和39%。谭爱萍等[28]将分离自广东地区患病龟鳖的67株气单胞菌同样采用K-B纸片法测定其药物敏感性，结果表明，此67株龟鳖源气单胞菌对4种喹诺酮类药物环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和氧氟沙星的耐药率分别为19.40%、22.39%、41.79%和52.24%。Deng等[29]对分离自患病水产动物的106株气单胞菌进行药物敏感性测定，结果表明，龟鳖类、观赏鱼源的分离株对喹诺酮类药物的耐药情况较养殖鱼类和虾类的严重。由此可见，一些经济价值较高、养殖密度较大或工厂化养殖的品种如龟鳖类、特色经济鱼类、观赏鱼等其分离的病原菌对氟喹诺酮类药物的耐药率比大宗淡水养殖鱼类、养殖虾类等的高，其耐药率可达60%以上，这可能与在这些品种养殖周期长、用药频繁等有关。

在喹诺酮类耐药性研究中还发现，水产品中分离的食源性细菌及在无发病情况下采集的水产动物、养殖环境样品分离菌对氟喹诺酮类的耐药率均偏低(10%以下)。付溥博等[30]采用药敏纸片扩散法对进出口水产品中分离的320株副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)进行药敏测试，受试菌对萘啶酸、吡哌酸和诺氟沙星3种喹诺酮药物的耐药率均不超过3%。Jiang等[31]采用琼脂稀释法测定了市场采集分离的鱼源大肠杆菌的敏感性，结果显示，只有4.1%的菌株对环丙沙星耐药。刘颖等[32]对46株金黄色葡萄球菌水产品分离株进行药敏试验，结果显示，受试菌对环丙沙星的耐药率为4.3%。冯永永等[33]在广东5个养殖场分离到317株气单胞菌(均分离自未发病鱼及其养殖环境)，其对氟喹诺酮类药物较敏感，对环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星的耐药率分别为14%、11%和3%。

目前我国水产养殖中细菌对不同喹诺酮类药物的耐药率各有差异，第一代和第二代的喹诺酮类药物的耐药性较高(对萘啶酸的耐药率超过60%)，而对氟喹诺酮类药物仍较敏感，但是近几年来氟喹诺酮类耐药性已呈现增长趋势，喹诺酮类药物的耐药风险仍不容小觑[34]。在缺乏对喹诺酮类药物使用的有效管理措施下，若出现大量不合理使用喹诺酮类药物的状况，那势必会出现水产动物致病菌对喹诺酮类药物产生更加严重的耐药性，给水产动物的细菌性病害防治带来难题，同时也会严重影响水产品的质量安全。

3 水产动物源细菌质粒介导的喹诺酮类耐药基因研究概况

自1998年质粒介导的喹诺酮类耐药基因发现以来，国内外对此耐药基因的研究逐渐增多。各项研究显示，质粒介导的喹诺酮类耐药基因在世界各地均有发现，其分布广泛且种类丰富，已报道的包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qnrVC、qepA、aac(6′)-Ib-cr和oqxAB 9种基因，还有一系列基因亚型[12]。关于水产养殖源质粒介导的喹诺酮类耐药的研究正处于起步阶段，目前在水产动物和水(海)产品上检出的质粒介导的喹诺酮类耐药基因型主要包括qnrA、qnrB(qnrB1、qnrB17、qnrB20)、qnrD1、qnrS(qnrS1、qnrS2、qnrS5)、qnrVC(qnrVC4、qnrVC6、qnrVC7)、aac(6′)-Ib-cr及oqxAB(表1)。其中，qnrS2和aac(6′)-Ib-cr在气单胞菌和大肠杆菌中检出频率最高，在各类水产动物中流行广泛[28,39,33,35-53]。qnrVC是弧菌特有的质粒介导的喹诺酮类耐药基因型，主要在弧菌中流行[14-16]。据已报道文献，质粒介导的喹诺酮类耐药基因主要在一些特色经济鱼类如罗非鱼、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、鳗鲡(Anguillajaponica)等，观赏鱼如锦鲤(Cyprinuscarpiokoi)、热带鱼及龟鳖动物分离的细菌中检出。在上述文章中也提到[28-29]，这些水产动物源的分离菌株对喹诺酮类药物的耐药率相对于其他品种高，可能与这些水产动物的养殖模式、养殖周期、用药习惯等密切相关。

在喹诺酮类药物的选择压力下，质粒介导的喹诺酮类耐药基因可通过质粒、整合子等耐药元件在不同种细菌间交换传递，对细菌耐药性的产生和扩散起着重要的作用。随着测序技术的提高和广泛应用，不少学者开始从质粒介导的喹诺酮类耐药阳性质粒的序列特征上揭示这些耐药基因产生及传播的机制。2011年，印度学者Majumdar等[35]首次对自鱼源嗜水气单胞菌分离的携带qnrS2的耐药质粒pBRST7.6进行全序列测序，该质粒大小7621 bp，IncQ型，含有6个开放阅读框(ORF)、5个编码序列(CDS)，qnrS2位于编码orf6的开放阅读框中。西班牙学者Marti等[36]对自水环境分离菌株中提取的一个多重耐药质粒pP2G1进行全序列分析，发现其质粒同时携带两个质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrS2和aac(6′)-Ib-cr，并且aac(6′)-Ib-cr还位于Ⅰ类整合子的基因盒阵列中。另外，冯永永等[33]也发现，aac(6′)-Ib-cr可单独或与利福平耐药基因arr3位于同一个Ⅰ类整合子基因盒阵列中。已有报道显示，qnrS2多位于IncQ和IncU等可接合质粒上[35,43,46,52]，也可位于非接合性ColE型质粒上[47]。有报道表明[15,31,44,48,50-51]，质粒介导的喹诺酮类耐药基因与其他类药物的耐药基因如四环素类耐药基因、β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、磺胺类耐药基因等共同存在同一质粒或整合子基因盒中，从而增强细菌多重耐药的发生，这大大提高了临床对患病水产动物治疗难度，而且给水产品的质量安全带来风险，不仅是水产养殖面临的挑战，也是关系到我们每个人生命健康的重要问题。

4 小结与展望

从发现至今，喹诺酮类药物已广泛应用于水产动物细菌病的治疗[6,54-55]，随之而来的是水产动物病原菌对喹诺酮类药物产生的耐药性问题；而食源性细菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌，虽然不是水产动物的病原菌，但也可在水产品中分离到，可能与养殖、加工、流通等环节有关，食源性细菌的耐药性问题在近年来已经逐渐受到人们的重视。由于耐药菌和耐药基因可在不同细菌不同环境介质中交换传递，也可通过食物链传递给人类，因此水产动物中存在的耐药菌和耐药基因风险均对食品安全和人类身体健康产生潜在危害[56]。

由于水产养殖动物的种类繁多、个体差异较大和特殊的生长环境等原因致使科研工作者对于喹诺酮类药物药效动力学及药代动力学的研究很难覆盖到所有的水产养殖动物，这就导致当相应的病害发生时，对喹诺酮类药物的使用缺乏全面的科学用药指导。世界范围内每年都会有大量的喹诺酮类药物用于水产养殖业，当喹诺酮药物在水产动物体内代谢不完全时，在环境压力的选择下会促进细菌耐药性的产生。这便要求科研工作者更加严格地掌握各种疾病的适应症，对比该药物的药效动力学及药代动力学参数，提供最适合的药物使用量与使用的间隔时间，以保证有效治疗疾病的同时减少喹诺酮类药物的排出和在动物体内的残留，从而减少细菌对喹诺酮类药物产生抗药性的可能。总之，科学合理地使用抗菌药物是减少喹诺酮类药物耐药性产生的重要措施之一。

质粒介导的喹诺酮类耐药是细菌对喹诺酮药物产生耐药性的重要途径之一，由于质粒拥有特殊的水平转移机制使其耐药性的传播更为便捷，而且一般携带质粒介导的喹诺酮类耐药基因的菌株初期仅对喹诺酮类药物表现为低水平耐药，因此此类耐药很难通过表型检测；但通过逐步累积或者偶联协同其他耐药机制则会产生高水平的耐药。因此，有必要建立完善的质粒介导的喹诺酮耐药机制的检测方法，采用PCR等分子生物学手段对养殖场以及养殖场附近环境进行监测。另外，应开展质粒介导的喹诺酮类耐药发生及传播机制的研究，给出相应避免耐药的方法，如研发新型药物来破坏和消除喹诺酮耐药类相关的基因或蛋白等，避免喹诺酮类耐药的传播。

总之，要在自身的思想观念上重视水产养殖细菌喹诺酮类耐药现象，科学、合理地使用喹诺酮类药物，同时大力开展喹诺酮类耐药机制的研究，减少喹诺酮类耐药性的传播，也要加强新型抗菌药物的研发，从多方面减少喹诺酮类耐药性的产生，以降低其对人类健康及自然环境的潜在危害。