稻田和池塘两种模式下金边鲤与建鲤肠道菌群差异分析

2020-07-31严雪瑜叶香尘韦玲静文衍红杨著山滕忠作吕业坚

水产科学 2020年4期

严雪瑜，叶香尘，韦玲静，文衍红，杨著山，滕忠作，刘康，吕业坚

( 1.广西壮族自治区水产引育种中心，广西南宁 530031； 2.柳州市渔业技术推广站，广西柳州 545006； 3.柳州市融水苗族自治县水产技术推广站，广西柳州 545300 )

鱼类作为一种水生动物，其自身体内及所生存的环境中都存在着大量的不同种类的微生物[1]。鱼类肠道作为营养物质消化吸收的场所，其内部的微生物受到宿主肠道环境及本身遗传特征等因素的影响，从而定殖成为肠道固有菌群[2]，形成了一个肠道微生物与宿主以及所处的水生环境相互制约、相互依赖的微生态系统[3]。稳定性良好的肠道微生物环境对于鱼类的消化、吸收、代谢、免疫调节和疾病防控等具有重要意义[4]。然而，鱼类肠道的微生物变化是动态的，其群落组成受到宿主种类、生长发育、饵料组成和环境因素等影响[5-7]。因此，通过分析鱼类肠道菌群结构上存在的差异及组成特点，可以获得更有利于鱼类生长健康的肠道微生物信息[8]。

我国稻田养鱼历史悠久，在养殖过程中，稻田里的杂草、浮萍以及浮游生物可为鱼类提供充分且营养丰富的饵料，这种养殖方式在保证鱼类生长和健康的同时还可改善水质以及水稻的生长条件，在一定程度上节约了养殖成本，实现资源的可持续利用[9]。因此，针对稻田养殖开发适宜的鱼类养殖品种十分必要。金边鲤(Cyprinuscarpiovar.jinbian，暂定名)因其背鳍两侧各有一条金黄色的“金边”而得名，是由广西水产引育种中心联合多个单位针对稻田养殖而选育开发的鲤鱼新品系[10]。金边鲤作为一个正在培育中的新品种，其遗传基础、生理特征及生活习性仍需进一步研究，了解其在稻田养殖模式下的生长适应情况，查明不同养殖模式对金边鲤肠道微生物的影响，对进一步探究金边鲤的生长发育机制具有十分重要的意义。因此，笔者拟通过对池塘和稻田的养殖模式下金边鲤和建鲤(C.carpiovar.jian)进行肠道宏基因组测序，分析不同鲤鱼的肠道菌群差异以及不同养殖环境对鲤鱼肠道菌群结构的影响，探讨和评估金边鲤在稻田养殖模式中的生长和适应情况，为金边鲤下一步的选育工作提供研究方向和理论依据，为完善和推广金边鲤的稻田养殖模式提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验用鱼以及试验场地均由广西融水县融荣水产繁殖场提供。试验鱼分别在水池中暂养7 d后随机挑选规格整齐、体质健壮的鱼各200尾，金边鲤体质量(15.7±2.0) g，体长(8.2±0.4) cm，建鲤体质量(13.2±2.3) g，体长(7.8±0.5) cm，分别在金边鲤和建鲤的眼睑处注射红色和绿色荧光标记后将2种鲤鱼平均分为2组，分别同塘(同稻田)混养90 d。池塘养殖密度为45 000尾/hm2，稻田养殖密度为6000尾/hm2。试验期间，池塘养殖日投喂人工配合饲料2次(8:30和18:00)，日投喂量为鱼体质量的2%;稻田养殖不投饲料。

1.2 样品采集

试验结束后试验鱼停食24 h，根据荧光标记分别从稻田和池塘中采集金边鲤和建鲤各15尾，标记为池塘金边鲤组(B1)、稻田金边鲤组(B2)、池塘建鲤组(N1)和稻田建鲤组(N2)；其中每组随机分成3个平行组，每个平行5尾鱼。按照无菌操作对样品进行处理，用无菌生理盐水冲洗肠管外壁，用2 mL冻存管收集肠道内容物样品后立即放入液氮中，随后置于冰箱-80 ℃保存备用。肠道内容物样品用干冰保存送至上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组文库构建和测序。

1.3 宏基因组高通量测序及生物信息学分析

将每个平行组的肠道内容物样品混合为一个样品，分别对每组样品进行MiSeq宏基因组PE文库构建和Illumina测序。将相似度大于0.97的序列归为1个运算分类单元(OTU)，统计各样品所含运算分类单元的数量，去除无法分类的运算分类单元后进行运算分类单元聚类分析和物种分类学分析，计算Alpha多样性指数中的丰富度(Chao、Ace)、多样性(Simpson、Shannon)和覆盖率，在生物学分类的门水平和属水平进行细菌群落结构和相对丰度分析，将标准化的操作分类单元比对京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库，进行群落功能分析。

1.4 数据分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0软件进行数据处理，运用独立样本t检验对每个平行组的α-多样性指数进行数据检验，运用单因素方差分析和Duncan′s多重比较对4组样品的α-多样性指数和菌群结构组成数据进行组间差异比较和显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA基因高通量测序结果分析

池塘金边鲤组、稻田金边鲤组、池塘建鲤组、稻田建鲤组分别产生377、250、367和455个运算分类单元，其中4组样品共有的运算分类单元数量为175个，而每组特有的运算分类单元数量分别为39、1、15和53个。此外，金边鲤的池塘组和稻田组产生的共有运算分类单元数量为201个，建鲤的池塘组和稻田组共有的运算分类单元数量为335个；而池塘养殖的金边鲤和建鲤共有运算分类单元数量为282个，稻田养殖金边鲤和建鲤的共有运算分类单元数量为240个。试验结果表明，池塘建鲤和稻田建鲤的相同运算分类单元数量最多，而稻田金边鲤和稻田建鲤也共享了较多相同的运算分类单元(图1)。

图1 各组样品运算分类单元数量比较分析

2.2 菌群多样性分析

在97%水平上对所有样品进行Alpha多样性分析，池塘金边鲤组的Ace指数和Chao指数均高于稻田金边鲤组，表明池塘金边鲤的肠道菌群群落丰富度高于稻田金边鲤；而稻田建鲤组的Ace指数和Chao指数高于池塘建鲤组，表明稻田建鲤的肠道菌群群落丰富度高于其池塘组。稻田金边鲤组的香农指数高于池塘金边鲤组，稻田建鲤组的香农指数亦高于池塘建鲤组，表明稻田养殖的金边鲤及建鲤的肠道菌群群落多样性均高于对应的池塘组；而辛普森指数结果与香农指数的结果相反，提示池塘组群落多样性的均匀度较好。4组样品的覆盖率指数均达0.998以上，表明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种(表1)。

表1 各组样品的α-多样性指数(n=3)

2.3 各组样品群落组成分析

2.3.1 样品优势操作分类单元丰度差异分析

选取所有样品中前50的优势丰度操作分类单元进行差异比较分析，结果见图2。不同养殖方式组间比较发现，建鲤的池塘组和稻田组之间的颜色相似度明显低于金边鲤的池塘组和稻田组的相似度，提示在稻田和池塘养殖模式下金边鲤的肠道优势菌群可能较建鲤的更稳定；而金边鲤的池塘组和稻田组也存在颜色差异，表明在不同生长环境下，金边鲤的肠道菌群结构和相对丰度各不相同。此外，同一养殖方式的组间比较发现，池塘养殖的金边鲤和建鲤之间的颜色差异小于稻田养殖金边鲤和建鲤之间的差异，提示池塘养殖模式下金边鲤和建鲤的肠道优势菌群相似性最高。试验结果表明，不同种类及不同生长环境均会对鲤鱼的肠道菌群产生一定的影响。

图2 各组样品优势操作分类单元丰度热图

2.3.2 样品菌群结构组成差异分析

在生物学分类门水平中，4组的优势菌门主要包括变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门、蓝细菌门、放线菌门、绿弯菌门和柔膜菌门。其中，池塘金边鲤组中最主要的优势菌门为变形菌门，占总数的89.56%，显著高于其他菌门(P<0.05)；其他3组的优势菌门均为变形菌门、梭杆菌门和厚壁菌门，但细菌丰度比例存在一定的差异(图3)。

图3 各组样品生物分类学门水平的微生物群落结构及相对丰度

在生物学分类属水平中，池塘金边鲤组的第一优势菌属为气单胞菌属(82.68%)，显著高于其他菌属(P<0.05)；而稻田金边鲤组的主要优势菌属包括气单胞菌属(Aeromonas)、鲸杆菌属(Cetobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、克雷伯菌属(Kkbsiella)和肠杆菌属(Enterobacter)，比例分别为32.43%、32.37%、12.79%、8.36%和6.14%，5种优势菌属差异不显著(P>0.05)；池塘建鲤组的前3个优势菌属为鲸杆菌属(35.72%)、气单胞菌属(27.94%)和乳球菌属(12.29%)，3种菌属差异不显著(P>0.05)；稻田建鲤组中除去未分类和未分级的菌属，主要优势菌属为鲸杆菌属(26.83%)、气单胞菌属(25.16%)和乳球菌属(8.50%)，几种优势菌属间差异不显著(P>0.05)(图4)。

图4 各组样品生物分类学属水平的微生物群落结构及相对丰度

2.4 肠道微生物16SrRNA基因功能预测分析

基于各组样品的操作分类单元丰度水平进行肠道微生物16S rRNA基因功能预测，比对获得了229个信号通路，分别选取每组样品的前50个信号通路进行比较分析，其维恩图见图5。由图5可见，各组样品的肠道微生物操作分类单元共富集到45个相同的信号通路。各组样品共有的信号通路见图6，通过图6可以看到其肠道微生物主要为多种物质的代谢途径，包括丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、脂肪酸、乙醛酸、二羧酸、丙酮酸、丙酸、丁酸、烟酸、烟酰胺、甲烷、果糖、甘露糖、淀粉、蔗糖、氨基糖、核苷酸糖、甘油磷脂、卟啉、叶绿素、嘌呤、嘧啶和氮代谢，还有赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、肽聚糖、脂肪酸、叶酸、泛酸、CoA和酰基-tRNA等生物合成途径，以及光合生物中的碳固定、原核生物中的碳固定、柠檬酸循环(TCA循环)、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、氧化磷酸化、ABC转运、蛋白质输出、核糖体、磷酸转移酶系统(PTS)和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等代谢通路，表明鱼类肠道微生物的主要功能是参与各类物质的代谢；此外，还富集到了细菌趋化性、鞭毛组装、细菌分泌系统、双组分系统、同源重组和错配修复等信号传导、调节和修复机制途径，提示鱼类肠道微生物可能具有一定的免疫和修复调节等功能。此外，不同养殖模式组间比较发现，池塘组和稻田组建鲤的肠道微生物参与的信号通路基本一致，而池塘组和稻田组金边鲤的肠道微生物参与的信号通路存在一定的差异，其中池塘金边鲤组特异富集到了谷胱甘肽代谢、色氨酸代谢、β-丙氨酸代谢以及泛醌和其他萜类化合物—醌生物合成等通路，提示不同生长环境会对金边鲤的肠道微生物的功能产生一定的影响。

图6 各组样品共有信号通路比较分析

3 讨论

3.1 不同生长环境对鱼类肠道菌群结构的影响

在正常的生长环境下，生物体内的大多数微生物在调节机体的各种生命功能方面起着积极的作用[11]。大量水产养殖研究表明，由于水生动物生活环境的特殊性，养殖模式、池塘水质、饲料类型等环境影响因素以及发育阶段、肠道结构、营养水平和系统发育地位等变化均可打破微生物与生物之间的平衡，从而影响水生动物消化道中微生物的种类和数量[12-14]。研究证实，微生物环境可以通过水环境、饲料等引起草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肠道菌群结构发生改变[15-16]。此外，同一养殖环境下的不同鱼类，其肠道微生物群落的组成还可能会受到食性、栖息地和基因型的影响[17-19]。孟晓林等[20]发现，不同质量浓度的铜可影响鲤鱼肠道菌群的多样性和结构组成，并对鲤鱼肠道上皮免疫屏障造成损伤。本研究发现，不同生长环境下的金边鲤和建鲤肠道菌群均存在一定的差异，提示养殖环境会对鲤鱼的肠道微生物群落结构产生不同程度的影响。该结果与李建柱[21]的研究结果基本一致，即在鱼菜共生模式下，草鱼、鲫鱼(Carassiusauratus)、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙鱼(Aristichthysnobilis)等4种不同的鲤科鱼类肠道微生物的菌落组成和优势菌落具有一定的相似性，但是与其他养殖模式中鱼类的肠道微生物菌落却具有差异性[21]。大量研究证实，鱼类的肠道菌群受多种因素的影响，但这些因素的独立或协同作用机制有待进一步研究。

3.2 不同品种鲤鱼肠道微生物优势菌群比较分析

大量研究表明，梭杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和变形杆菌门是脊椎动物肠道的核心菌群，其中变形菌门是鱼类肠道微生物中最主要的优势菌群之一[22]，而拟杆菌属(Bacteroides)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和梭杆菌属(Fusobacterium)中的专性厌氧菌是淡水鱼的肠道优势内源性菌群的主要种类[23]。王琴等[24]研究发现，在池塘中主养草鱼混养不同比例鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼和匙吻鲟(Polyodonspathula)的3种混养模式下，草鱼肠道菌群相似性较高，主要菌群包括变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和厚壁菌门等。李建柱[21]则发现，草鱼、鲫鱼、鲢鱼和鳙鱼4种鲤科鱼类肠道微生物的主要优势菌门包括梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门，优势菌属包括鲸杆菌属、梭状芽胞杆菌属、拟杆菌属和芽孢杆菌属等。王蕾[25]发现，变形菌门、蓝细菌门、厚壁菌门和放线菌门等细菌门类存在于胚胎期、仔稚鱼期和幼鱼期的鲤鱼样本中；而混养池塘中6月龄的鲤鱼肠道菌群中含量较高的菌门为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、柔膜菌门和梭杆菌门，优势菌属为气单胞菌属和乳球菌属，鲫鱼和草鱼肠道菌群种类与鲤鱼相似，但优势菌和组成比例具有一定的差异。而黄进强等[26]发现，盐碱塘养殖鲤鱼肠道细菌归属于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和梭杆菌门，弧菌科中的气单胞菌属为优势菌属。本研究发现，金边鲤和建鲤的主要肠道微生物均归属为变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门和蓝细菌门等，主要优势菌属包括气单胞菌属、鲸杆菌属和乳球菌属等，且品种间无显著差异，与其他鲤科鱼类的研究结果基本一致。

3.3 金边鲤肠道微生物优势菌群作用分析

池塘金边鲤组的优势菌为变形菌门和气单胞菌属，占有绝对优势；而另外3组在门分类水平和属分类水平的菌群结构和相对丰度较为相似，优势菌门均为变形菌门、梭杆菌门和厚壁菌门，主要优势菌属为鲸杆菌属、气单胞菌属和乳球菌属。其中乳球菌属是水生动物的一类重要肠道益生菌，对宿主的免疫调节具有重要作用，可以增强宿主免疫力，其在生长过程中会产生细菌素和乳酸，抑制某些病原细菌的生长，抵抗病原菌入侵肠道[27]。而鲸杆菌属具有发酵多肽碳水化合物的能力，并且可以产生维生素B12[28]，在鱼类的消化和营养过程中起到重要的作用。而在正常情况下，气单胞菌在健康鱼类的肠道中是有益的[14]，该细菌可以通过阻止病原菌在肠道和养殖环境中过多繁殖，从而改善水体环境和提高宿主的免疫力[29]，因此，鱼类肠道中气单胞菌为优势菌种可能也是适应养殖环境的一种表现[26]。本研究发现，与池塘组相比，金边鲤在稻田养殖模式下的肠道菌群结构更为丰富，并且与相同养殖条件下的建鲤无显著差异，其优势菌群在正常情况下基本属于有益菌群，提示金边鲤可以很好地适应稻田和池塘养殖环境。