大蒜素对大菱鲆幼鱼生长及抗病力的影响

李会涛，黄 滨，刘宝良，刘 滨，王蔚芳

( 1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所，青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071； 2.山东百福生物科技有限公司，山东 济宁 273200 )

大蒜素，是大蒜中活性成分的总称，主要成分为二烯丙基三硫醚，天然存在于百合科植物大蒜的鳞茎中，具有抗菌消炎、驱虫杀虫、诱食促生长、提高免疫力抗病力等功效，且具有在动物体内无积存、无耐药性、无毒性等特点[1]。大蒜素因其存在于广大民众的日常生活中，作为饲料添加剂被认为是天然无公害的抗生素替代物。

在水产养殖中，应用大蒜素作为饲料添加剂在淡水鱼中开展了广泛的研究，涉及鲤鱼(Cyprinuscarpio)[2]、鲫鱼(Carassiusauratus)[3]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[4]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[5]、暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)[6]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[7]、罗非鱼(Oreochromis)[8]等，研究内容涵盖促生长[5-7]、提高抗氧化机能[9]、提高非特异免疫力[3,5,9-10]、改善肌肉品质[2,7,9]、防治肠炎病[11]、防治寄生虫[12-14]等方面。在海水鱼方面，仅见大蒜素防治大菱鲆(Scophthalmusmaximus)肠炎病的生产性试验报道，其研究结果指出，大蒜素对预防大菱鲆肠炎病有明显的疗效，但对患病鱼的治疗效果不明显[15]。

大菱鲆，是从欧洲引入我国的海水养殖名贵鱼种，现已成为我国北方工厂化养殖的主要品种之一。然而，伴随着养殖的快速发展，一些疾病也随之而生，肠炎病是其主要病害之一，患病鱼死亡率高，损失大[16-18]。为了减少养殖生产中抗生素的使用，发展“绿色渔业”，笔者以大蒜素为研究对象，结合生产实际，将其拌入饲料(黏性大蒜素主要应用途径是拌入饲料中)，研究其对大菱鲆幼鱼生长、免疫力及抗病力的影响，以替代或减少抗生素的使用。

1 材料与方法

1.1 试验设计与养殖管理

在山东省莱州市朱由养殖场进行生产性的工厂化流水养殖试验，随机选取15个规格为5.0 m×5.0 m×0.6 m的水泥养殖池，每池放养3600尾大菱鲆幼鱼(采购鱼苗时按照数量投放)，为当年孵化的同一批鱼苗，规格匀称，平均体质量为(8.12±0.03) g(全池称量计算)。

黏性大蒜素购自北京渔经生物技术有限公司，其中二烯丙基三硫醚含量为60%。大菱鲆商业配合饲料购自青岛七好营养科技有限公司，水分含量10%，粗蛋白含量52%，粗脂肪含量10.5%，粗灰分8.1%。试验共分为5组，每组设3个平行，大蒜素的添加量为0(对照)、100、200、400、800 mg/kg，计算好饲料用量后，称取大蒜素(以二烯丙基三硫醚含量计算)拌入饲料中即刻进行投喂，进行为期6周的养殖试验。因大菱鲆为抢食性鱼类，饲料投入水体后即刻会被抢食，因此维持均匀的投饵速度可以保证饵料在入水的同时被鱼摄食，避免拌入饲料中的大蒜素流失到水体中。

养殖期间，日投喂率为大菱鲆体质量的1.5%，每日平均分3次(6:00、12:00和18:00)投喂，每周进行1次抽样检测体质量(每池鱼随机抽样10次，每次捞取20尾鱼，称量质量，计算平均体质量)，及时调整投饵量。投喂前停水，投喂2 h后恢复流水，记录每池鱼的死亡数。试验期间，水流速5 L/min，水温13～15 ℃，溶解氧>6 mg/L，盐度30。

1.2 样品采集

养殖试验结束时，饥饿24 h后，全池称量质量。随后每池随机挑选10尾鱼，自其尾静脉采血，室温下静置1 h后于冰箱4 ℃保存过夜，次日离心(5000 r/min，4 ℃，30 min)分离血清，分装并于冰箱-80 ℃保存待用。

1.3 指标检测

血清中补体C3含量、溶菌酶和超氧化物歧化酶活性分别采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法、比浊法和黄嘌呤氧化酶法进行测定。测定所用的试剂盒均购自南京建成生物技术研究所。

1.4 攻毒感染试验

攻毒感染试验用菌株为鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，菌株来自中国海洋大学水产学院[19]。鳗弧菌接种在2216E固体培养基上，28 ℃培养24 h后，用灭菌生理盐水洗下，稀释成108cfu/mL的活菌液，置于冰箱4 ℃待用。

养殖试验结束时，每池随机挑选20尾鱼，分别放在预先准备好的58 cm×47 cm×33 cm泡沫箱中进行攻毒感染试验，泡沫箱中水体的体积为60 L。每尾鱼腹腔注射0.1 mL的活菌液后，连续观察14 d，统计感染死亡率。攻毒期间正常投喂，每次投饵2 h后整箱换水，气石充氧，记录死亡数量。

1.5 计算公式

特定生长率/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

存活率/%=nt/n0×100%

饵料系数=F/n1/(mt-m0)

感染死亡率/%=n2/n×100%

式中，m0为初始平均体质量(g)，mt为终末平均体质量(g)，t为试验时间(d)，n0为初始鱼数量(尾)，nt为终末鱼数量(尾)，F为总投饵量(g)，n1为存活鱼数量(尾)，n2为感染死亡鱼数量(尾)，n为试验鱼数量(尾)。

1.6 数据统计与分析

试验数据以平均值±标准误表示，采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，当总体方差差异显著时(P<0.05)，则进行Tukey多重比较。

2 结 果

2.1 大蒜素对大菱鲆幼鱼生长的影响

大菱鲆幼鱼的特定生长率随着饲料中大蒜素含量的增加而逐渐升高(表1)，并在大蒜素添加量为200 mg/kg及以上时显著高于对照组(P<0.05)。对照组的幼鱼存活率显著低于添加组(P<0.05)。饲料系数随着大蒜素含量的增加而逐渐降低，并在大蒜素添加量为100 mg/kg及以上时显著低于对照组(P<0.05)，但在200 mg/kg及以上时保持稳定。

2.2 大蒜素对大菱鲆幼鱼相关免疫指标的影响

大蒜素对大菱鲆幼鱼非特异性免疫指标的影响见图1～3。血清补体C3含量随着大蒜素含量的增加呈先升后降的趋势，在200、400 mg/kg组达到最大值并显著高于其他各组(P<0.05)。溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力则随着大蒜素含量的增加而逐渐升高，并在大蒜素含量达到400 mg/kg及以上时不再有显著变化(P>0.05)。

图1 饲料中不同含量的大蒜素对大菱鲆幼鱼血清中补体C3含量的影响

图2 饲料中不同含量的大蒜素对大菱鲆幼鱼血清中溶菌酶活力的影响

2.3 大蒜素对大菱鲆幼鱼抗病力的影响

大菱鲆人工感染试验表明，感染死亡率随着饲料中大蒜素含量的增加而逐渐降低，并在摄食大蒜素含量为400、800 mg/kg时显著低于其他各组(P<0.05)，但400、800 mg/kg组间差异不显著(P>0.05)(图4)。

图3 饲料中不同含量的大蒜素对大菱鲆幼鱼血清中超氧化物歧化酶活力的影响

图4 饲喂不同含量大蒜素的大菱鲆幼鱼经攻毒后的感染死亡率

3 讨 论

3.1 大蒜素对大菱鲆幼鱼生长的影响

大蒜素作为一种安全的饲料添加剂，其味道可刺激动物的嗅觉和味觉，提高动物食欲，增加摄食量，促进生长。大蒜素对淡水鱼类的促生长作用研究较多，如鲤鱼[2]、草鱼[4]、虹鳟[5]、团头鲂[7]、罗非鱼[8]等，但海水鱼的相关报道较少。本研究表明，饲料中添加大蒜素有利于大菱鲆幼鱼的生长，提高其成活率，并降低饲料效率，适宜的添加量为200 mg/kg。试验结果与淡水鱼一致，并符合大菱鲆生产性试验结果[15]，但却在大蒜素的应用剂量上存在差异。饲料中大蒜素含量在15～100 mg/kg间可以促进鲤鱼、虹鳟、团头鲂、罗非鱼等生长。在大菱鲆生产性试验中，则以25 kg冰鲜杂鱼加24.75 kg大菱鲆专用粉末料再加0.25 kg大蒜素，搅拌均匀加工成饵料投喂以促进其生长[15]。本试验是在生产性的工厂化流水养殖条件下进行的，这也是我国北方沿海养殖大菱鲆的常见模式，其养殖环境和养殖管理等与前述精细的养殖试验大为不同，这可能是导致剂量差异的一个原因。此外，应用大蒜素作为饲料添加剂在海水鱼中开展的研究比较少，无法参考比较海水鱼和淡水鱼对大蒜素的需求量差异。因此，大蒜素应用剂量的差异可能受到了多种因素的影响，包括鱼种、试验鱼大小、饲养环境、大蒜素有效含量等。今后需结合实际应用大蒜素进行养殖试验和养殖生产，并开展更多的海水鱼相关应用研究，为进一步开发和应用大蒜素提供依据，为绿色养殖提供借鉴。

3.2 大蒜素对大菱鲆幼鱼非特异性免疫力的影响

鱼类是低等的脊椎动物，其特异性免疫机制尚不完善，因此，非特异性免疫在其防御体系中发挥重要的作用。补体系统是鱼体非特异免疫系统中重要的组成部分，补体C3是补体系统中含量最多的成分，能够发挥溶菌杀菌、免疫调节、免疫复合物溶解和清除等生物学功效，在鱼类抵抗微生物感染过程中扮演重要角色[20-21]。本研究中，血清补体C3含量在400 mg/kg组达到峰值，进一步增加大蒜素含量反而显著降低补体C3含量，但仍显著高于对照组。这与鲫鱼[3]的研究结果相似，饲料中添加250 mg/kg大蒜素能显著提高其血清中补体C3含量，而500 mg/kg大蒜素则显著抑制其含量，并且显著低于对照组。笔者推测，这可能与高剂量大蒜素会影响炎性细胞对靶细胞的杀伤作用有关，在鲫鱼[3]的研究中还发现，当500 mg/kg大蒜素组鲫鱼在改投喂不含大蒜素的基础饲料后，其补体C3含量升高并恢复到对照组水平。因此，大蒜素的剂量、动物种类等会影响补体C3的合成。

溶菌酶广泛存在于生物的黏液、血清和吞噬细胞的溶酶体颗粒中，能水解革兰氏阳性菌的细胞壁，使内容物逸出进而起到杀菌作用[22]，其活性在一定程度上能反映鱼的非特异性免疫状态。Fernandez-Trujillo等[23]指出，鱼类的溶菌酶活性远强于高等脊椎动物。在本试验中，血清溶菌酶活力随着大蒜素含量的增加而显著升高，并在大蒜素含量达到400 mg/kg时不再有显著变化。结果与淡水鱼类的研究一致，即饲料中添加大蒜素均能提高暗纹东方鲀、草鱼、镜鲤、虹鳟等淡水鱼的溶菌酶活力[5,6,9,24]。康淑媛等[3]报道指出，停喂大蒜素后，鲫鱼体内溶菌酶活性在一段时间内仍然保持较高水平。因此，大蒜素能够增强鱼类溶菌酶活性，提高鱼类非特异性免疫能力，究其原因可能与大蒜素可激活组织中吞噬细胞的分泌功能有关，从而促进溶菌酶大量释放[25]。

超氧化物歧化酶是生物体内抗氧化酶系的重要酶类，是体内以活性氧自由基为底物的酶类和自由基连锁反应的阻断剂，检测抗氧化指标可以反映机体的抗氧化能力和免疫状态。本试验结果表明，血清超氧化物歧化酶活力随大蒜素含量的增加而显著升高并在大蒜素含量达到400 mg/kg时不再有显著变化。李婵等[5]报道，饲料中添加大蒜素能够增加虹鳟肾脏、肝脏和血浆中超氧化物歧化酶活力。徐奇友等[9]对镜鲤的研究表明，饲料中添加大蒜素增加了肝胰脏超氧化物歧化酶活力，但却降低了血清中超氧化物歧化酶活力。超氧化物歧化酶活力在组织间的差异说明大蒜素的作用效果因鱼种、组织等因素而不同。

本试验结果表明，饲料中至少添加400 mg/kg的大蒜素能够更有效提高大菱鲆幼鱼的特异性免疫力，大蒜素的应用剂量也高于淡水鱼[3]。此外，相关研究报道指出，大蒜素能够提高鱼、虾的非特异性免疫基因表达[26-27]。因此，今后可考虑进一步从细胞、蛋白质、基因等水平研究大蒜素的作用机制，并利用体内和体外试验的对比研究来探讨其作用机制，为进一步利用大蒜素提供参考。

3.3 大蒜素对大菱鲆幼鱼抗病力的影响

为进一步验证大蒜素在提高大菱鲆幼鱼机体非特异性免疫力基础上是否能够抵抗病害，在养殖结束时对大菱鲆幼鱼进行了人工细菌感染试验。试验结果发现，摄食大蒜素含量为400、800 mg/kg时，大菱鲆的感染死亡率显著低于其他各组。说明饲料中至少添加400 mg/kg的大蒜素能够显著提高大菱鲆幼鱼抗肠炎病的能力。相关研究报道也指出，大蒜素可以预防鱼类的寄生虫和细菌性疾病[12-14]，与本试验结果相似。日后，进一步应用大蒜素防控鱼病值得继续研究和深入探讨。

4 结 论

本研究表明，饲料中至少添加200 mg/kg的大蒜素有利于大菱鲆幼鱼的生长，而400 mg/kg的大蒜素能够更有效地提高其免疫力及对抗肠炎病的能力。