植物WRKY 转录因子及其在非生物胁迫中的研究进展

卢雯瑩，秦素研，戴晋，刘美茹，袁曼曼

（漯河市农业科学院，河南 漯河 462300）

为应对生态环境不断恶化的严峻考验，植物在生长发育时逐渐形成了复杂的信号网络调控。研究表明，WRKY 家族转录因子能与靶基因启动子中的顺式作用元件W-box（TTGACC/T） 特异性结合，从而调控目的基因的表达，并广泛参与植物生长发育、非生物胁迫等应激响应。了解植物WRKY 转录因子及其参与非生物胁迫调控机制，对未来植物抗逆相关基因挖掘、抗逆遗传育种等具有实际意义。对WRKY 转录因子的结构、分类及其在部分非生物胁迫响应中的研究进展进行综述，旨为相关研究提供信息参考。

1 WRKY 转录因子的结构及分类

WRKY 蛋白属于WRKY 家族，是植物中较大的转录因子家族之一[1]，最早从甜土豆中分离出来[2]，随后又在拟南芥、水稻和大豆等多种植物中被发现和报道。WRKY 蛋白的名字来源于它们都含有1 个长度为60 个氨基酸左右的WRKY 结构域，其N 端含保守的WRKYGQK 序列[1]，C 端含有1 个Cx4-5Cx22-23HxH（简称C2H2） 或者Cx7Cx23HxH（简称C2HC） 的锌指结构[3]。WRKYGQK 序列是WRKY 结构域的核心序列，其突变往往导致WRKY 蛋白结合DNA 的活性降低甚至丧失[4]。WRKY 结构域的首个溶液结构主要由4 条β 折叠构成，伴随有Cys/His 残基组成的锌指结构[5]。WRKYGQK 序列主要位于N 端的β 折叠上，使得该序列可以部分从蛋白表面伸出，进而有助于WRKY 蛋白与DNA 结合。Duan 等[6]报道的拟南芥WRKY1 蛋白晶体结构得到了相似的WRKY 结构域，只是其有1 个额外的β 折叠，使该结构域看起来更明显。此外，WRKY 的结构与NAC 和GCM 转录因子的DNA 结合域相似，表明WRKY 与NAC 和GCM 在进化上有很大的相关性[5，7]。WRKY 与GCM 锌指结构相似，但NAC缺乏WRKY 的核心序列WRKYGQK。这些相似结构是否具有其他作用，目前仍不清楚[5]。

WRKY 结构域和锌指结构是WRKY 蛋白的2 个重要组成部分，根据二者数量或类型的不同，可以将其分为3 个组（Group）：GroupⅠ含有2 个WRKY 结构域，Group Ⅱ和Group Ⅲ仅含有1 个；GroupⅠ和GroupⅡ含有相同的C2H2锌指结构，而Group Ⅲ含有特殊的C2HC 锌指结构；根据氨基酸序列的不同，Group Ⅱ可以进一步分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe 5 个亚组[1]。系统发育树分析表明，高等植物的WRKY家族可以更精确地分为GroupsⅠ、Ⅱa+Ⅱb、Ⅱd+Ⅱe和GroupsⅢ[8，9]。

凝胶阻滞、酵母单杂交、共转染、转录激活等试验均证明WRKY 转录因子可以与下游基因启动子中的一些保守序列结合，这些序列被称为W-box，通常包含TTGACC/T 结构[1，10]。尽管几乎所有报道的WRKY蛋白都能结合到相同的核心序列（TGAC） 上，但WRKY 转录因子又是如何特异性地分辨各自靶基因的启动子呢？Ciolkowski 等[11]利用凝胶阻滞试验研究了拟南芥5 种WRKY 蛋白后发现，除W-box 的核心序列是WRKY 蛋白结合所必需的之外，W-box 的侧翼序列也能部分决定WRKY 的偏好性，如AtWRKY6、AtWRKY11 对5’端毗邻鸟嘌呤残基的W-box 具有 很高的亲和性，而AtWRKY26、AtWRKY38 和AtWRKY43 对5’端毗邻腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶残基的W-box 具有很高的亲和性。CTGACC 和TTGACA 不能被5 种WRKY 蛋白结合，表明类W-box序列并不具有W-box 序列的功能，W-box 元件应为TTGACC/T 结构[7]。生物信息学分析和功能研究均发现在胁迫诱导型启动子中含有多个W-box 元件[12]，串联的W-box 能够增强WRKY 转录因子结合的效率，如多个W-box 对PcWRKY1 的转录效果具有协同性[13]，大麦HvWRKY38 需要3 个毗邻的W-box 才能有效地结合[14]。但也有少数研究发现，WRKY 转录因子可以结合非W-box 元件来发挥功能。OsWRKY13 既可以结合Wbox 序列，又可以结合PRE4 元件（TGCGCTT）[15]；HvWRKY46 能同时结合W-box 和SURE 元件（TAAA GATTACTAATAGGAA）[16]；NtWRKY12 可以结合糖响应类似元件（TTTTCCAC），而不能结合W-box[17]。

2 WRKY 在非生物胁迫中的作用

早期的转录组分析揭示出WRKY 转录因子可能参与到非生物胁迫反应中，近年来，越来越多的研究证实了WRKY 在植物响应非生物胁迫中扮演着重要角色。响应热激的特异启动子HSP101 过表达水稻的WRKY11 基因研究发现，OsWRKY11 能够增强水稻的耐旱性，表现为减缓叶片萎蔫，提高绿色部位的存活率[18]。过表达OsWRKY45 和OsWRKY72 能够增强水稻对盐和干旱的耐受性[19，20]。PEG、NaCl 和ABA 处理能够增强OsWRKY08 的转录活性，从而通过正调控2种不依赖于ABA 的胁迫响应基因AtCOR47 和AtRD21 的表达来提高转基因拟南芥的渗透胁迫[20]。另外，过表达GmWRKY54 也能够增强植物对盐胁迫和干旱胁迫的耐性，而GmWRKY13 的过表达则会增加对盐胁迫和甘露醇胁迫的敏感性[21]。NaCl 和盐胁迫能够强烈地诱导TcWRKY53 的表达，且过表达TcWRKY53 会导致2 种ERF 家族基因NtERF5 和NtERFBP-1 的表达下调[22]。ABA、干旱和NaCl 处理能够增强拟南芥2 个紧密相关的WRKY 转录因子AtWRKY25 和AtWRKY33 的转录，且Atwrky33 的无效突变体和Atwrky25Atwrky33 双突变体都表现出对NaCl 敏感性增强，而过表达AtWRKY25 和AtWRKY33 其中1 个都可以增强拟南芥对NaCl 的耐受性[23]。

研究表明，WRKY 蛋白在ABA 信号途径中可能扮演激活子或者抑制子的角色，LtWRKY21 可以正调控ABA 相关基因的表达，瞬时表达试验分析表明，对于同一个ABA 诱导型启动子，OsWRKY24 和Os WRKY45 起抑制作用，而OsWRKY72 和OsWRKY77则起激活作用[24]。Atwrky2 的T-DNA 插入突变表明，AtWRKY2 负反馈调控ABA 介导的种子萌发[25]。AtWRKY57 和AtWRKY63 均参与拟南芥对干旱和ABA的响应，其中，AtWRKY57 直接调控ABA 合成基因的表达，而AtWRKY63 则直接调控ABA 下游基因ABF2 的表达[26，27]。Shang 等[28]发现3 类WRKY 蛋白（AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60） 在种子萌发的过程中负调控ABA 信号，进一步的遗传分析表明AtWRKY40 是3 类WRKY 转录因子中主要的负调控因子，能够通过结合启动子下游的W-Box 序列而直接抑制几种重要的ABA 响应基因AtABF4、AtABI4、AtABI5、AtDREB1A、AtMYB2 和AtRAB18 的表达；高浓度的ABA 能够从细胞核中招募AtWRKY40 到细胞质中，使AtWRKY40 与ABA 相互作用，从而促进ABA 响应基因的表达。单突变体、双突变体、三突变体以及过表达试验表明，AtWRKY18 和AtWRKY60 对于敏感型植株起正调控作用，从而抑制种子萌发和根系生长，同时它们也能够增强植株对盐胁迫和渗透胁迫的敏感性[29]。这些结果表明，WRKY 转录因子在ABA 信号途径中扮演重要的角色。

此外，越来越多的研究表明，WRKY 蛋白在植物营养胁迫中具有重要作用。AtWRKY6 同时参与拟南芥缺磷和缺硼的响应，AtWRKY6 能够抑制磷转运基因PHO1 的表达，在低磷情况下，AtWRKY6 蛋白的稳定性降低，导致其与PHO1 启动子的结合减弱，进而使PHO1 的表达下调[30]。Castrillo 等[31]进一步研究发现AtWRKY6 能够减少对砷的吸收，从而降低转座子的活性。此外，AtWRKY75 也参与缺磷的响应，并且能够调控拟南芥根系的发育[32]。

3 展望

WRKY 转录因子是植物特有的转录因子家族，自1994年发现第1 个WRKY 蛋白以来，借助遗传学和分子生物学的研究方法，WRKY 蛋白的研究取得了丰硕成果。迄今为止的报道表明，WRKY 不仅参与植物的生长发育，而且还能够参与多种非生物胁迫反应，如干旱、冷害、高温、高盐、营养匮乏等。绝大多数WRKY转录因子可以响应温度胁迫，以此避免温度变化带给植物的伤害；通过参与ABA 介导的信号通路提高植物对干旱胁迫的耐受性[33]。除此之外，它还积极响应盐胁迫和氧化胁迫等非生物胁迫[34]。WRKY 转录因子主要通过ABA、JA 和SA 等信号通过来调控植物的非生物胁迫反应，但其复杂的调控机制及相关信号通路之间的作用关系尚未完全清楚。通过对WRKY 家族的研究，采用转基因技术对作物进行改良，将有助于提高植物的抗逆性，帮助筛选抗逆性强的优良品种。