外周血lncRNA-LET对慢性乙型肝炎肝硬化的诊断价值

牛兴杰， 刘志慧， 崔凤梅， 刘耀敏， 王艳飞， 张国民， 刘金霞

1 承德医学院附属医院 感染性疾病科， 河北 承德 067000； 2 承德医学院 基础医学院， 河北 承德 067000

慢性乙型肝炎(CHB)的发病机制涉及多种炎性细胞之间的相互作用[1]。肝纤维化是肝硬化的早期可逆转阶段，目前学者研究[2]证实，在肝纤维化发展至早期肝硬化阶段，若能得到及时的诊断和治疗，肝纤维化甚至早期肝硬化仍是可逆的。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt，同时不编码蛋白质的一种RNA。研究[3]显示，lncRNA参与细胞各种生命活动的不同阶段，并认为其几乎参与到涉及生命周期的每一个过程。在一些复杂疾病中，相关信号通常来源于基因的非编码区域，目前研究[4]证实，lncRNA异常表达与人类重大疾病相关，如心血管疾病、各种癌症、阿尔茨海默病等，lncRNA作为潜在的诊断、治疗及预后指标，受到了越来越多学者的关注。本研究探讨分析外周血lncRNA-LET对CHB肝硬化的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究为前瞻性研究，选取2017年3月-2019年5月在承德医学院附属医院就诊的CHB患者183例，其中乙型肝炎肝硬化患者作为肝硬化组，无肝硬化病理改变患者作为非肝硬化组。同时，选择同期在本院健康体检的40例健康人群作为正常对照组。

1.2 纳入标准和排除标准 纳入标准：(1)CHB患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[5]相关诊断标准；(2)CHB患者均未进行抗病毒治疗；(3)纳入受试者自愿签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他肝炎病毒感染者，如HAV、HCV、HDV；(2)合并其他特殊病毒感染者，包括巨细胞病毒、EB病毒以及HIV等；(3)合并酒精性肝病以及非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病以及药物性肝损伤患者；(4)合并原发性或转移性肝细胞癌以及合并其他器官肿瘤患者；(5)合并风湿免疫系统疾病，与免疫功能异常相关其他疾病等。

1.3 检测方法

1.3.1 肝功能检测 取3组受试者清晨空腹静脉血2 ml，离心分离血清，置于-20 ℃冰箱内保存备用，采用放射免疫测定3组受试者肝功能指标，包括TBil、胆碱酯酶(ChE)、总胆汁酸(TBA)以及Alb。

1.3.2 外周血lncRNA-LET水平检测 取3组受试者空腹静脉血5 ml于EDTA抗凝管中，离心分离血清，于-80 ℃冰箱内保存备用。总RNA提取：取出样品解冻后加入Trizol试剂，混匀后加入氯仿，震荡，离心后取上层无色液体，加入异丙醇混匀后离心，弃去上清，加入焦碳酸二乙酯溶解。逆转录制备cDNA：参考逆转录试剂盒操作说明书进行。实时荧光定量PCR：参照荧光定量PCR试剂盒使用说明书，反应条件：95 ℃ 3 min预变性，95 ℃ 30 s变性、58 ℃ 30 s退火、72 ℃ 30 s延伸，共完成35个循环，绘制熔解曲线分析PCR产物，每孔设置3个复孔，取3个孔平均值，以GAPDH作为内参基因，以2-△△Ct表示相对表达量。lncRNA-LET上下游引物分别为：5′-GTTGTTGTTGCATTGGG-3′，5′-AAGATGGAGAGTGGAGCCT-3′。

1.3.3 肝组织学检查 若有严重并发症无法进行肝穿刺活检患者，根据影像学及临床诊断确诊，其余患者进行肝穿刺活检，其中共有156例患者接受组织学检查。受检查在B超定位下，采用16G肝穿刺经皮负压针吸活检，吸取肝组织，样本使用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，对切片进行HE染色、Masson三色染色，病理诊断结果由3位有经验的病理医师阅片。按照《慢性病毒性肝炎临床与病理的诊断标准》[6]纤维化分期(S)标准将肝纤维化程度分为S0～S4五期，S4级为早期肝硬化或肯定的肝硬化。对于合并严重凝血功能异常、大量腹水等无法进行肝穿刺活检患者，根据影像学及临床诊断，确诊为肝硬化，则作为S4期。

1.4 伦理学审查 本研究经承德医学院附属医院伦理委员会审批，批号：2016HL008。患者均知情同意。

1.5 统计学方法 采用统计学软件SPSS 22.0进行数据处理分析。计量资料采用表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。计数资料组间比较采用χ2检验。等级资料组间比较采用Kruskal-WallisH秩和检验。相关性分析采用Pearson相关性分析。采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析外周血lncRNA-LET对肝硬化的预测价值。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入CHB患者175例，其中男101例、女74例，肝硬化组52例(代偿期患者39例、失代偿期患者13例)，非肝硬化组123例。3组受试者性别、年龄比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)，非肝硬化组患者与肝硬化组患者HBV DNA比较差异亦无统计学意义(P>0.05)，而肝硬化组患者HBeAg阳性及活动性CHB比例均显著高于非肝硬化组(P值均<0.05)(表1)。

2.2 3组受试者肝功能指标比较 肝硬化患者和非肝硬化患者血清肝功能指标TBil、TBA、Alb以及ALT均显著高于正常对照组，而血清ChE显著低于正常对照组(P值均<0.05)；肝硬化患者血清肝功能指标TBil、TBA、Alb以及ALT均显著高于非肝硬化患者(P值均<0.05)，血清ChE显著低于非肝硬化患者(P值均<0.05)(表2)。在肝硬化患者中，Chid-Pugh分级A级21例、B级18例、C级13例。

2.3 3组受试者外周血lncRNA-LET水平比较 肝硬化组患者与非肝硬化组患者外周血lncRNA-LET相对表达量显著低于正常对照组(P值均<0.05)，其中肝硬化组患者外周血lncRNA-LET相对表达量显著低于非肝硬化患者(P<0.05)(表3)。

2.4 CHB患者不同纤维化分期外周血lncRNA-LET水平比较 根据CHB患者纤维化分期标准，S0期患者16例、S1期患者25例、S2期患者47例、S3期患者35例、S4期患者52例。随着患者肝纤维化分期的增加，lncRNA-LET相对表达量显著降低(P值均<0.05)(表4)。

表3 3组受试者外周血lncRNA-LET水平比较

表4 CHB患者不同纤维化分期外周血lncRNA-LET水平比较

2.5 CHB患者外周血lncRNA-LET与肝纤维分期、肝功能的相关性 Pearson相关性分析结果显示，CHB患者外周血lncRNA-LET相对表达量与肝纤维化分期、TBil、TBA、Alb、ALT呈负相关(r值分别为-0.352、-0.372、-0.364、-0.410，P值均<0.001)，与ChE呈正相关(r=0.340，P<0.001)。

2.6 CHB患者外周血lncRNA-LET对肝硬化的预测价值 ROC曲线分析外周血lncRNA-LET对肝硬化的预测价值，结果显示，ROC曲线下面积为0.934，最佳截断值为0.833，敏感度为84.57%，特异度为80.57%(图1)。

表1 3组受试者一般资料比较

表2 3组受试者肝功能指标比较

3 讨论

肝纤维化是多种慢性肝病进展为肝硬化的必经过程，晚期肝纤维化的持续存在常常可导致肝硬化甚至原发性肝癌的发生[6]。目前越来越多的研究认为，肝纤维化甚至早期肝硬化是可逆的[7]，因此对于肝硬化的诊断成为学者关注的重点。肝硬化作为慢性肝炎发生发展的一个重要环节，大部分肝癌的病理生理过程均与肝硬化的演变密切相关。既然肝硬化与肝癌之间的发生发展具有着密切的联系，那么在肝硬化的早期阶段对疾病进行干预，逆转肝硬化病程的进展，对于阻止肝癌的发生发展成为新的可能[8]。肝硬化的发生及发展作为一个复杂的病理过程，涵盖了肝细胞的坏死凋亡、间充质细胞的增殖以及细胞外基质的沉积破坏等过程，因此有学者[9-10]提出，可能存在具有差异性表达的lncRNA可通过影响肝细胞凋亡以及间充质细胞增殖等过程从而影响肝硬化疾病进程。

lncRNA是一类长度在200个核苷酸以上的RNA分子，随着目前新一代高通量测序技术的发展和广泛应用，在各类生物体中均发生大量具有生物学功能的lncRNA[11]。目前研究[12-13]显示，lncRNA广泛参与生物体内多种重要的生理病理过程，可以从观遗传水平、转录水平以及转录后水平等多个方面对靶基因进行调控。在肝硬化不同阶段均伴随着肝脏炎症损伤、细胞凋亡以及损伤后修复等过程，在不同阶段细胞损伤凋亡都有所不同，lncRNA对肝硬化的调控机制，可能与调控肝细胞凋亡、间充质细胞增殖等有关[14]。目前有研究[15]报道显示，lncRNA-LET在肝癌患者中出现异常表达，而鉴于肝硬化与肝癌之间的密切联系，笔者推测是否可将lncRNA-LET作为CHB肝硬化的诊断指标，从而为患者诊断及干预提供依据。

本研究结果显示，肝硬化组与非肝硬化组患者外周血lncRNA-LET相对表达量显著低于正常对照组(P值均<0.05)；肝硬化组患者外周血lncRNA-LET相对表达量显著低于非肝硬化患者(P<0.05)。提示在乙型肝炎患者中可出现lncRNA-LET表达量的降低，且肝硬化患者lncRNA-LET表达量更低。有报道[16-17]显示，在肝癌组织中lncRNA-LET相对表达量较癌旁正常组织显著降低，本研究进一步证实，在CHB向肝硬化甚至肝癌发展进程中具有差异性表达。针对患者肝纤维化进程进行lncRNA-LET表达水平的比较，结果显示，随着患者肝纤维化分期的增加，lncRNA-LET相对表达量显著降低(P<0.05)，CHB患者外周血lncRNA-LET相对表达量与肝纤维化分期呈显著负相关关系(r=-0.352，P<0.001)。提示随着肝纤维化进程的发展，患者外周血lncRNA-LET表达量明显降低，进一步证实了lncRNA-LET异常表达与患者肝纤维化进程明显相关。基于上述研究，发现lncRNA-LET与CHB肝硬化的发生发展有关，而是否可以将其作为患者肝硬化的诊断指标之一，研究采用ROC曲线分析其诊断价值，结果显示，ROC曲线下面积为0.934，最佳截断值为0.833，提示lncRNA-LET对CHB肝硬化具有良好的诊断价值。但是由于本研究纳入样本量较小，且仅针对患者外周血lncRNA-LET水平与疾病进程进行分析，有关lncRNA-LET对肝硬化的调控机制，仍需要进一步深入研究分析；此外，本研究缺乏lncRNA-LET与其他血清学诊断方式的比较，下一步研究还需与各种常用血清学指标进行对比分析或联合运用，以更好地指导临床工作。

综上所述，外周血lncRNA-LET随着CHB肝纤维化进程的发展，其表达水平有所降低，且对CHB肝硬化具有较好的诊断价值，可成为肝硬化诊断的潜在生物学指标。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：牛兴杰、刘志慧、刘耀敏负责课题设计，资料分析，撰写论文；刘志慧、王艳飞、张国民参与收集数据，修改论文；崔凤梅、刘金霞等负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。