细胞焦亡在肝脏疾病中的作用

肖伟松， 乐滢玉， 曾胜澜， 覃小宾， 吴 聪， 牙程玉， 毛德文

1 广西中医药大学 研究生学院， 南宁 530222； 2 广西中医药大学第一附属医院 肝病一区， 南宁 530023

肝脏炎症已被证实与肝硬化、感染诱导的肝纤维化以及肝细胞癌(HCC)发展过程中的细胞焦亡有关[1]。细胞焦亡参与了针对细胞内细菌感染的免疫防御机制。作为促炎性程序性细胞死亡的一种新形式，正常情况下，有助于及时清除感染细胞，但越来越多的证据表明过度的炎症小体激活会诱发无菌炎症，导致大量细胞死亡、严重组织损伤和器官衰竭，并最终导致某些疾病，例如急性或慢性肝炎和肝纤维化。因此，本综述将重点论述细胞焦亡在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、酒精性肝病(ALD)、病毒性肝炎、肝纤维化和HCC发生、发展中的作用机制。

1 细胞焦亡的典型特征

细胞焦亡是依赖caspase-1/4/5/11介导的一种新型的程序性细胞死亡，caspase-1/4/5/11是一类促炎性半胱氨酸蛋白酶，均属于caspase家族。细胞焦亡是机体应对细菌入侵的重要先天免疫反应。但是，过度的细胞焦亡可能会导致败血性休克和其他免疫疾病。有研究[2]表明，在各种微生物和内源性刺激的情况下，人类的caspase-1/4/5和小鼠的caspase-1/11被激活以裂解gasdermin D(GSDMD)蛋白，导致巨噬细胞和中性粒细胞的细胞膜破裂，证明焦亡细胞质膜的破裂与GSDMD蛋白密切相关，caspase-1/11能够切割GSDMD的接头结构,释放gasdmin-N端结构域,然后其与质膜的内部小叶相结合发生寡聚化,在细胞膜上形成1～2 nm的孔隙,从而增大了细胞膜的通透性,K+外流、Na+内流,细胞的离子梯度消失,细胞内渗透压增加,细胞膜失去了调控物质进出的能力,迅速膨胀,最终导致细胞渗透性崩解。损伤相关分子模式(DAMP)等细胞内容物释放到细胞外环境中，募集更多细胞因子，进一步延续组织中的炎症级联反应。细胞焦亡主要受两个主要途径调控：caspase-1诱导的经典型炎症途径和caspase-11诱导的非经典型炎症途径[3]。在经典型细胞焦亡中，来自细胞膜的一系列DAMP通过典型的炎症小体激活caspase-1，从而释放GSDMD-N末端以引发焦亡。对于非经典型细胞焦亡，细胞质脂多糖(LPS)激活capase-4/5/11后,主要通过裂解GSDMD来诱发细胞程序性死亡，其发生不同于经典型，不依赖于炎症小体和caspase-1。

1.1 经典细胞焦亡途径分子机制 经典型细胞焦亡途径的激活主要由多种病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)和DAMP触发，依赖于模式识别受体(pattern-recognition receptor,PRR)接受危险信号分子刺激,通过ASC招募caspase-1前体(pro-caspase-1)组装形成炎症小体，并激活caspase-1分子进一步切割下游GSDMD目的蛋白,最终促进细胞焦亡的发生[4]。炎症小体一般包括3个主要成分[5]: (1) 感受器:位于细胞质内的PRR, 主要有NOD样受体 (NOD-like receptor，NLR)和黑色素瘤缺乏因子2样受体 (absent in melanoma 2，AIM2) ; (2) 效应器:pro-caspase-1; (3) 凋亡相关微粒蛋白 (apoptosis associated speck-like protein containing a CARD, ASC) :将PRRs与pro-caspase-1结合起来的衔接蛋白。新兴证据[6]表明，已经鉴定出5个典型的炎性小体，包括NLRP1、NLRP3、NLRP4、NLRP7和IFI16，均可由不同的刺激触发[6]。在细胞焦亡的最初过程[7]中，炎症小体通过NOD样受体(NLRP1、3、6、7、12，NLRC4)和AIM2激活caspase-1，同时通过ASC的同源蛋白互作结构域和C端半胱天冬酶募集域(CARD)的寡聚化来募集上下游的PRR和pro-caspase-1,组装成炎症小体进行下游的信号转导。通过CARD-CARD相互作用将pro-caspase-1募集到ASC中，导致其裂解成N端前结构域和C端催化和相互作用结构域；形成二聚体的pro-caspase-1进一步裂解成为p10亚基、p20亚基，并激活其自身的蛋白酶生成caspase-1。炎性体复合物的形成最终导致caspase-1的活化，将会诱导促炎性前体细胞因子(pro-IL-1β和pro-IL-18)的蛋白水解，从而释放出活性的IL-1β和IL-18,最终诱导细胞焦亡。

1.2 非经典细胞焦亡途径分子机制 多年来，caspase-1介导的途径被认为是介导焦磷酸化的唯一途径。但在2011年，Kayagaki等[8]观察到caspase-11对于感染大肠杆菌、啮齿动物柠檬酸杆菌和霍乱弧菌的巨噬细胞中IL-1β的产生和焦磷酸化至关重要，可激活小鼠巨噬细胞中caspase-11介导的信号传导途径，导致IL-1β/IL-18的成熟和释放，这揭示了细胞焦亡的另一条调控途径。与经典型途径不同,非经典型焦亡途径依赖于caspase-4/5/11的激活。具体而言，caspase-4/5/11通过其CARD结构域直接与LPS尾部的脂质体A相结合，可促进其自身的寡聚化和激活，活化的胱天蛋白酶裂解GSDMD可产生具有生物活性的GSDMD-NT，从而导致细胞焦亡的发生[9]。因此，在非经典型细胞焦亡途径中，炎症小体的装配对于caspase-4/5/11介导的GSDMD裂解不是必需的。GSDMD-NT引起caspase-1依赖性NLRP3炎性小体的激活，导致IL-1β和IL-18的分泌。随着研究的不断深入细化,一些新的分子机制逐渐被发现[10]。Pannexin-1是细胞膜上的通道蛋白,控制小分子物质进出,caspase-11的激活会导致Pannexin-1蛋白断裂形成通路,将ATP释放到细胞外,当P2X7受体受到ATP长期反复的刺激时,P2X7通道开放使K+、Na+、Ca2+外流,打破细胞膜内外离子平衡,细胞发生渗透性肿胀进而膜破裂,最终导致细胞死亡。值得令人思考的是，LPS可直接与caspase-4/5/11的CARD域结合，但不与其他caspase结合。目前的研究尚不足以解释其具体作用机制，需要对LPS结合的caspase-4/5/11进行结构性研究以证实这些发现。

1.3 细胞焦亡的关键蛋白——GSDMD 最近的研究[11]已确定蛋白GSDMD是活性caspase-11和caspase-1的主要底物。Gasdermin(GSDM)蛋白家族是先天免疫和细胞死亡反应的调节剂。GSDMD包含一个N末端(gasdermin-N)和一个C末端(gasdermin-C)，两者通过一个环连接。gasdermin-N结构域具有强大的成孔活性，可与gasdermin-C结构域相互作用并受其抑制。激活的caspase-1和4/5/11裂解了GSDMD中的连接环，从而启动了gasdermin-N结构域的自抑制作用。未释放的gasdermin-N结构域通过与膜磷酸肌醇结合而迁移到质膜上，促使细胞膜穿孔，从而引起细胞肿胀并最终导致渗透裂解。GSDMD孔释放细胞内容物，包括炎性细胞因子IL-1β和IL-18，这是caspase-1的其他底物。此外，活化的caspase-11裂解pannexin-1(ATP的膜通道)的胞质区，从而诱导ATP的细胞外释放，后者以自分泌或旁分泌的方式与P2X7受体结合，从而打开P2X7的通道，最终，小分子物质(例如Na+，水，胞质蛋白和促炎因子)将从通道流出，而较大的细胞器(如核糖体)将在细胞中被阻塞，最终导致细胞死亡，并在细胞周围引发一系列免疫炎症反应[12]，从而导致细胞焦亡。GSDMD属于gasdermin家族，其包含人类的6个成员和小鼠的10个成员。所有家族成员(DFNB59除外)都具有两域结构，其gasdermin-N结构域能够诱导细胞焦亡。最近的研究[13]表明，GSDME、GSDMA和GSDMA3的gasdermin-N结构域也能够在体外的脂质体或单层膜上形成孔，提示了gasdermin家族采用了一种成孔机制来裂解细胞并执行焦磷酸化，这可能将焦磷酸化重新定义为gasdermin介导的程序性坏死细胞死亡。但是，gasdermin-N结构域组装孔以穿透脂质膜的机制尚不清楚。

2 细胞焦亡与肝脏疾病的关系

2.1 细胞焦亡与ALD的关系 ALD是慢性肝病和导致肝纤维化、肝硬化的一个重要病因。由于ALD的损伤机制错综复杂,具体致病分子机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗策略。故对ALD的发病机理和分子调控机制的了解将有助于开发良好的诊断指标以及预防和治疗方法。近年来发现细胞焦亡可能是ALD发生、发展的关键机制。Khanova等[14]使用RNA测序分析发现，经组织学验证的酒精性肝炎患者和小鼠肝组织中的caspase-4/11基因上调，但慢性酒精性脂肪性肝炎小鼠和健康的人类肝脏中没有。另有研究[15]表明，在酒精喂养的小鼠中NLRP3、caspase-1和IL-1β高表达，而在NLRP3-/-或caspase-1-/-小鼠中，肝脏炎症和脂肪变性却明显减弱。由此可见，NLRP3炎性小体参与了ALD的发生发展，酒精对细胞焦亡的影响是由PAMP和DAMP所触发，例如ATP和可溶性尿酸，从乙醇诱发受损的原代肝细胞中释放，并触发炎性依赖性细胞因子的释放，刺激并维持ALD的炎症周期。在肝细胞中酒精代谢也增加活性氧(ROS)的产生和导致线粒体功能障碍，从而增加炎性细胞因子对肝细胞的敏感性。此外，酒精还可通过叉头盒蛋白O1降低肝细胞中miRNA-148a的表达，并诱导硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP，α-arrestin家族成员)的过表达。TXNIP结合并促使NLRP3炎症小体的活化，从而导致caspase-1介导的细胞焦亡。值得重视的是，有研究[16]证明慢病毒传递引起的肝细胞特异性表达miRNA-148a可直接抑制硫氧还蛋白与NLRP3之间的相互作用，从而减缓细胞焦亡和降低ALD的发生率。上述报告提供了证据和方向，表明NLRP3炎性小体在ALD的发展过程中具有致病性，但是，启动NLRP3激活的触发因素尚待确定。

2.2 细胞焦亡与NAFLD的关系 NAFLD是一种无过量饮酒史, 以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的临床病理综合征。其病程包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝纤维化, 最后可能演变成肝硬化和HCC。目前对于NALFD病理机制认识尚浅，缺乏有效的治疗对策，因此如何延缓NAFLD进展并尝试逆转这一过程一直是倍受关注的话题。研究[17]发现在NAFLD发展成为NASH的过程中, 细胞焦亡具有十分重要的作用，NLRP3炎性小体的激活加速了这一病理进程，并加重了肝脏的炎症反应。最近的研究[18]表明，与普通饮食喂养的小鼠相比，NAFLD小鼠的NLRP3、ASC和caspase-1的表达明显增加。在HepG2和L02细胞中证实了相同的结果，表明抑制NLRP3活性会降低两种细胞系中脂质的积累。另有试验[19]发现，NAFLD患者肝脏的NLRP3、IL-1β、IL-18和pro-caspase-1 mRNA水平显著高于健康人群。值得重视的是，NAFLD发病的始动因素与胰岛素抵抗有着紧密的联系。而NLRP3可通过激活与胰岛素抵抗相关的炎性因子(IL-1β、IL-18和NF-κB)，促进NAFLD的病理进展。此外，在NAFLD状态下，肝细胞承受过度的氧化应激，产生过量的ROS。使TXNIP与硫氧还蛋白分离，从而激活了NLRP3。有研究[20]表明TXNIP上调会导致IL-1β和IL-18的分泌增多，加重肝脏炎症反应。在NASH模型中，具有IL-1α和IL-1β基因敲除的小鼠显著减缓了从脂肪变性到脂肪性肝炎的病理过程，而IL-1β通过与TNFα的协同作用增加了肝细胞的TG水平并诱导肝细胞死亡。由此可见，抑制NLRP3炎性小体形成和活化的过程，能够减弱肝脏细胞焦亡后引起的肝脏炎症反应、细胞损伤和脂肪变性的现象, 具有一定减缓NAFLD的作用。

2.3 细胞焦亡与病毒性肝炎的关系 病毒性肝炎是肝炎病毒感染肝细胞并引起高病死率的肝脏炎症，其中约90%可归因于HBV和HCV引起的慢性感染, 严重的病毒性肝炎发展成肝纤维化、肝硬化甚至HCC。值得注意的是，NLRP3炎性小体是病毒性肝炎发生发展的潜在因素。研究[21]发现，活动性未经治疗的慢性HBV患者肝脏的NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达水平明显高于慢性缓解的患者。此外，在HBV感染者中，IL-1β的水平与肝脏炎症的严重程度之间存在很强的相关性，由此可见，NLRP3介导的IL-1β是HBV诱导的病毒性肝炎的潜在驱动力。此外，有关HCV感染的研究[22]表明，Kupffer细胞已被鉴定为慢性HCV感染者IL-1β的主要细胞来源，Kupffer细胞产生的IL-1β与炎症反应增强有关。另外NLRP3炎性体亦能刺激肝细胞中脂质滴的形成，从而促进HCV的形态变化和复制，加速了肝脏疾病的进展。因此，进一步研究HBV和HCV与肝脏细胞焦亡关系, 能够更深层次的探索人肝炎病毒诱导肝脏疾病产生和发展的致病机制。

2.4 细胞焦亡与肝纤维化的关系 肝纤维化是各种病因导致的细胞外基质 (ECM) 的形成与降解失衡, 使得ECM过度沉积并最终可发展为肝硬化和HCC。近年来发现，NLRP3炎性小体的激活在肝纤维化的发病机理中具有十分重要的作用。在肝纤维化的病理过程中，最显著的表征是肝星状细胞 (HSC)的激活。HSC具有促纤维化、促炎效应等性质, 激活过程中分泌多种ECM的成分, 如α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白等。在HSC中的NLRP3炎症小体活化可导致α-SMA阳性细胞数量增加, 而α-SMA阳性是HSC活化的关键标志物, 与肝纤维化的发展密切相关。因此, NLRP3炎症小体活化可激活HSC, 继而导致肝纤维化发生、发展。研究[23]表明，与NLRP3-/-和ASC-/-小鼠相比，野生型小鼠具有更高的α-SMA表达和更大的天狼星红染色面积，诱发严重的肝纤维化，证明了上述观点。相反，小鼠NLRP3炎性小体的激活促进了肝脏炎症和纤维化的病理过程。值得注意的是，活化的caspase-1、IL-18和IL-1β信号传导也是使得NLRP3炎性小体活化，从而导致肝纤维化发展的关键。IL-1β和IL-18均可诱导胶原蛋白的沉积。有报道[24]MCC950是一种可阻断NLRP3炎性体的药物，降低肝脏caspase-1的表达以及巨噬细胞和中性粒细胞的数量，最终缓解肝纤维化，说明通过阻断NLRP3炎性小体激活可能是治疗肝纤维化的关键机制。研究[25]表明，肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)对肝纤维化具有调节作用。血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是RAS的关键分子，它诱导NADPH氧化酶4/线粒体来源ROS的生成并加剧肝纤维化，而NLRP3的激活与两者的生成紧密相关。Ang Ⅱ的抑制作用通过减少ROS的产生并影响NLRP3炎性小体的活化而减轻了肝纤维化。NF-κB信号在肝纤维化的病理过程中也很重要[26]，NLRP3炎性小体的活化则伴随着NF-κB信号的上调。抑制NF-κB信号传导以及促进HSC凋亡可改善肝纤维化。这些因素与NLRP3炎性小体的激活密切相关，由此可见，通过探索对NLRP3炎性小体活性抑制的具体分子作用机制，从而预防和治疗肝纤维化将是一个很好的选择。

2.5 细胞焦亡与HCC的关系 HCC是肝脏中最常见，最具侵略性的原发肿瘤，治疗选择有限。手术切除被认为是标准的治疗方法之一。但HCC仍表现出较高的术后复发率，进展迅速且预后极差。迫切需要寻找新的HCC治疗靶点。细胞焦亡作为一种新的细胞程序性死亡方式, 可能是继细胞衰老、凋亡后新的治疗HCC的方法。Xia等[27]发现，NLRP3在HCC组织中的表达显著下调，甚至完全不存在，并且与HCC的病理分级和临床分期呈负相关，表明NLRP3炎性小体参与了HCC的发展进程。考虑到HCC发生率的性别差异，17β-雌二醇(E2)和雌激素受体(ER)β等因素也受到了重视。研究[28]表明，ERβ的表达在HCC组织中也降低，并且发现用E2激活的NLRP3炎性小体通过E2/ERβ/MAPK信号处理的HCC细胞系(SMMC7721、BEL7402和HepG2细胞)最终改善了HCC的进程。此外，E2处理激活的NLRP3炎性体诱导HepG2细胞中的caspase-1依赖性凋亡，导致HCC进程受到抑制。结果表明，E2和ERβ通过激活NLRP3炎性小体引发焦磷酸化，发挥抗癌作用。另外，关于晚期HCC的研究[29]发现, AIM2炎症小体通过阻滞mTOR-S6K1信号通路, 使雷帕霉素靶蛋白对S6K1蛋白的激活作用减弱, 从而抑制HCC细胞生长、增殖, 且AIM2炎症小体的堆积会使HCC细胞发生焦亡, 进而发挥抗肿瘤效应。表明通过诱导AIM2炎症小体表达, 增强细胞焦亡的效应, 可能延缓HCC的进展。综上所述，细胞焦亡有关的因素具有促进和抑制肿瘤发生的双重机制。以药理学靶向NLRP3炎性体可能会抑制HCC的增殖和转移，这表明这可能是一种新的治疗策略。

3 总结与展望

综上所述，细胞焦亡作为一种新型炎性相关的程序性死亡方式，其在慢性肝脏疾病发生发展扮演着极其重要的角色，通过阻断相关分子(例如NLRP3 caspase、IL-1)抑制焦磷酸化影响肝病的进展，并为肝病提供了一种潜在未来的治疗方法。但是基于细胞焦亡研究肝脏疾病的领域仍然存在着许多需要解决的问题：(1)由于焦磷酸化是抵抗病原体必不可少的防御路线，抑制磷酸化可能会增加机会性感染，目前，要转化为临床疗效，仍需要大量的研究。(2)PRR激活和细胞稳态之间的相互作用及其对生理功能的影响仍在研究中,许多PRR的功能和特异性配体仍然未知,了解受体激活机制和配体识别的受体结构对于设计新的免疫疗法将是至关重要的。(3)此外，肝纤维化中炎症小体信号传导的机制尚有许多未知，需要进一步研究以阐明炎症小体类型及其在不同类型肝损伤中的作用之间的相关性，以期为开发抑制炎症小体组装或作用于下游信号分子的疗法提供机会。(4)值得注意的是，GSDMD主要在免疫细胞和胃肠道中表达，肝细胞中的表达水平可能较低。将来需要在免疫细胞和肝细胞中使用组织特异性GSDMD KO小鼠的工作将有助于确定细胞焦亡在免疫细胞与肝细胞中在酒精性肝炎的发病机制中的作用。(5)炎症和细胞焦亡在NAFLD发展的作用机制研究中，还需要在更大且独立的患者队列中验证肝脏GSDMD和GSDMD-N表达与NASH评分和纤维化指数之间的相关性，将其表达与疾病晚期(如NAFLD肝硬化)和/或NAFLD-HCC进行比较，可有助于确定其预后价值和治疗干预措施的适当疾病阶段。目前细胞焦亡调控肝脏疾病的具体机制尚不清楚, 还存在很多尚未阐明的关键科学问题。该领域的探索能够为预防和治疗慢性肝脏疾病提供新的方法和策略。

作者贡献声明：毛德文、肖伟松负责课题设计，资料分析，撰写论文，修改论文；毛德文、肖伟松负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿；乐滢玉、曾胜澜、覃小宾、吴聪、牙程玉参与收集数据。