滑胎安胎协定方调节PI3K信号通路对肾虚型复发性自然流产子宫内膜蜕膜化的影响*

张旻轶 楼毅云 傅 萍#

1 浙江中医药大学研究生院 浙江 杭州 310053

2 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

3 杭州市中医院 浙江 杭州 310007

复发性自然流产大多为早期妊娠丢失，是孕期常见现象，中医学将本病归之于“堕胎”“滑胎”等范畴。本研究在前期临床及实验研究的基础上，从肾虚型复发性自然流产入手，观察磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信号通路的相关分子血清和糖皮质激素激酶1（SGK1）、SGK2、SGK3以及子宫内膜蜕膜化标志分子泌乳素（PRL）在肾虚型复发性自然者蜕膜组织中的mRNA的表达，以及应用滑胎安胎协定方后蜕膜细胞中SGK1和PRL的相对表达，以探讨滑胎安胎协定方对妊娠早期子宫内膜蜕膜化的进程的影响。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：经杭州市中医院伦理委员会批准，符合中西医诊断标准和纳入标准[1-2]，选取2013年1月～2018年12月期间在杭州市中医院就诊的妊娠早期（妊娠12周之前）者为研究对象，其中正常早期妊娠要求人工流产者26例作为正常对照组，年龄21～43岁，平均28.69±1.39岁；人工流产次数0～2次，平均0.20±0.09次；孕周6～10周，平均8.04±0.23周。肾虚型复发性自然流产26例为实验组，年龄19～37岁，平均27.96±0.89岁；自然流产次数2～3次，平均2.00±0.11次；孕周7～11周，平均8.50±0.26周。两组资料比较，无统计学差异（P＞0.05）。

1.2 蜕膜收集及处理：收集流产者子宫蜕膜组织，50ml离心管，预先分装生理盐水，按上述纳入和排除标准分组收集对照组和实验组蜕膜组织，将清宫术中取出的蜕膜组织放入生理盐水中，置于冰盒内，术后1小时内带回实验室。生理盐水充分洗涤蜕膜组织，尽量除去血块及血细胞，吸水纸吸净蜕膜组织表面生理盐水，剪碎后冻存管分装，液氮中冻存1小时，在-80℃冰箱冻存。

1.3 药物制备：受试药物制备按本研究组前期临床研究方案制备[3]。精密称取菟丝子、覆盆子、桑寄生、苎麻根各200g，阿胶、当归、杭白芍各150g（滑胎安胎协定方），碾碎制成粗粉，混合后回流提取，旋转蒸发浓缩，之后滤过，滤液减压回收定容，至250ml，灭菌分装备用；取1ml滑胎安胎协定方混合提取物（2g/ml），加入培养液后配制母液（30mg/ml），EP管分装，放于-20℃冰箱冻存备用。

1.4 蜕膜细胞培养：无菌条件下取得正常妊娠早期人流术后蜕膜组织，放入1%双抗的培养基，用消毒的眼科剪将蜕膜组织剪碎，消化过滤，1000rpm离心，裂解后置于5%二氧化碳（CO2）培养箱内过夜。用上述制备的滑胎安胎协定方受试药物处理蜕膜细胞，设为中药组，培养过夜，并设同期对照组。

1.5 Real-time PCR法检测PI3K信号通路相关分子mRNA的表达：Trizol一步法提取蜕膜组织和培养后蜕膜细胞的总RNA，总RNA浓度测定后进行PCR扩增，应用逆转录聚合酶链反应法测定蜕膜组织中SGK1、SGK2、SGK3、PRL、PKD1、CD44和CD44v6的mRNA表达水平，以及测定蜕膜细胞对照组和中药处理组中SGK1和PRL的mRNA表达水平。

1.6 统计学分析：采用SPSS16.0软件分析，计量资料以均数±标准误(±s)表示，进行t检验及方差分析。以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫蜕膜组织中PI3K信号通路相关分子的mRNA表达：对纳入本研究的26例正常早期妊娠者（对照组）和同期26例肾虚型复发性自然流产患者（实验组）的子宫蜕膜组织中SGK1 mRNA水平进行分析，发现实验组蜕膜组织中的SGK1 mRNA表达较对照组下降（P＜0.01），本研究印证了我们前期的研究结果[3]。见图1。

图1 正常对照组与实验组蜕膜组织中SGK1 mRNA表达

图2 正常对照组与实验组蜕膜组织中PI3K信号通路上相关分子的mRNA表达

以GAPDH为内参，对SGK1的另两个亚型SGK2和SGK3、PRL、PDK1、CD44及CD44v6在正常对照组和实验组蜕膜组织中的表达进行Real time PCR分析，SGK2和SGK3这两个SGK的异构酶在实验组蜕膜组织中的mRNA表达低于同期正常对照组（P＜0.01)；子宫内膜蜕膜化标志分子PRL在实验组蜕膜组织中的相对表达量亦低于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01)。见图2。

2.2 滑胎安胎协定方对蜕膜细胞中SGK1、PRL mRNA表达的影响：以滑胎安胎协定方处理蜕膜细胞，本研究应用Real time PCR分析对照组以及中药组蜕膜细胞中SGK1和PRL的表达。SGK1在滑胎安胎协定方处理组中的相对表达量高于对照组（P＜0.05)。子宫内膜蜕膜化标志分子PRL在中药组蜕膜细胞中的相对表达量亦显著高于对照组（P＜0.01)。见图3。

图3 滑胎安胎协定方对蜕膜细胞中SGK1、PRL mRNA表达的影响

3 讨论

复发性自然流产病因复杂，目前胚胎染色体核型异常是公认病因，但随着自然流产次数的增加，胚胎染色体异常的机率下降，提示其他主导机制的存在，如解剖学、免疫学、内分泌、微生物学以及血栓性疾病等[4-5]。中医学对本病的认识由来已久，《诸病源候论》列有“妊娠漏候”“妊娠胎动候”，指出“妊娠而恒腰痛者”，为“喜堕胎”之候，提示肾与胞胎的关系。胎者泰然蓬生，若肾气乏，则冲任不固，胞胎难系[6]。因此，本研究选取肾虚型复发性自然流产作为研究对象。

本研究所用滑胎安胎协定方（菟丝子、覆盆子、桑寄生、苎麻根、阿胶、当归、杭白芍）系名老中医临证经验方，方中菟丝子滋补肝肾、固精安胎，是为君药；覆盆子添精补髓、疏利肾气，是为臣药；桑寄生益肝肾祛风湿，苎麻根清热凉血止血，阿胶养血补血滋阴，杭白芍养血和营柔肝。全方温而不燥，补而不滞，共同起到益肾安胎的作用。根据药物组成的性味功效分析，滑胎安胎协定方对肾虚型复发性自然流产有治疗效应。

本研究结果表明肾虚型复发性自然流产者子宫蜕膜中PI3K信号通路上相关分子SGK1、SGK2、SGK3、PRL的mRNA表达显著降低，肾虚型复发性自然流产与子宫蜕膜中PI3K-SGK1通路的下调相关。滑胎安胎协定方提高蜕膜细胞中SGK1、PRL的表达，可通过调节PI3K信号通路，影响子宫内膜蜕膜化的正常进行，维持妊娠的正常进程，改善妊娠结局。本研究在前期研究的基础上，进一步阐述妊娠早期PI3K及其信号通路上相关分子的表达影响妊娠进程的机理，为中医补肾治疗提供分子理论基础，为中医药防治复发性流产研究提供新的思路。