补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝脏Hippo信号通路的影响*

杨晴柔 陈芝芸 何蓓晖 叶 蕾 严峻彬 严茂祥#

1 绍兴市第七人民医院 浙江 绍兴 312000

2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

肝纤维化（HF）是多种慢性肝病的最常见病理特征，可进展为肝硬化，最终导致肝癌。肝纤维化尚有逆转的可能，因此，寻找有效地抗肝纤维药物，具有重要的临床意义。中医药在抗肝纤维化方面具有独特的优势和巨大潜力；其抗肝纤维化的机制包括调控多条细胞信号传导通路，抑制肝脏炎症，抗脂质过氧化损伤，抑制肝星状细胞（HSCs）的活化和增殖，调节纤维化因子的合成和分泌，以及调节合成和细胞外基质（ECM）的降解等[1]。近年来的研究发现，Hippo信号通路参与肝纤维化的发生发展[2]。补肾化瘀方是课题组多年用于治疗肝纤维化的中药复方，前期机制研究发现，该方能通过调控Hh信号通路、TGF-β1/smad3信号通路等的异常激活，抑制肝脏炎症和HSC的活化，抗肝纤维化进展[3-4]。为了进一步探讨补肾化瘀方抗纤维化的“多途径”多环节”“多靶点”作用机制，本研究观察该方对四氯化碳（CCl4）诱导的大鼠肝纤维化大鼠肝组织Hippo信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动物：SD雄性大鼠40只，SPF级，体重140±10g，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限公司［SCXK(沪)2013-0016］；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心，适应性喂养1周后开始实验造模。

1.2 药物与试剂：补肾化瘀方由仙灵脾、女贞子、黄精、党参、虎杖、丹参、郁金、积雪草（比例1.25∶1.25∶1.67∶1.25∶2∶2.5∶1∶1.25）等组成，由本院制剂室制成流浸膏。CCl4（批号：20140319）由上海凌峰化学试剂有限公司提供；总RNA提取试剂（批号：AK1703）、逆转录试剂盒（A140832A）、TB Green荧光定量 PCR试剂（批号：AH80345A）为宝生物工程(大连)有限公司产品；总蛋白提取试剂盒（批号：20190425）为江苏凯基生物技术股份有限公司产品；10%TGX Stain-FreeTMFastCastTMAcrylamide Kit（批号：64096791）为美国BIO-RAD公司产品，BCA定量试剂盒（批号：A90723）、GAPDH鼠单克隆抗体（批号：A85370844）、Potent ECL试剂盒（批号：A82610615）为杭州联科生物技术有限公司；Mst1兔单克隆抗体（产品号：14946S、Yap鼠单克隆抗体（产品号：12395S）、Phospho-Yap兔单克隆抗体（产品号：13008S）为美国CST公司产品；CTGF鼠单克隆抗体（批号：C096）为美国Santa Cruz公司产品。

1.3 主要仪器：生物样品均质器（法国Bertin Technologies），核酸蛋白分析仪（英国柏精BioDrop）；全波长酶标仪（美国Bio-TeK）；荧光定量PCR仪（美国BIORAD）、垂直电泳及半干转系统（美国BIO-RAD）；双近红外分子成像系统（美国LI-COR）。

1.4 实验方法：40只大鼠按每组8只随机分对照组、模型组、BYHYF低剂量组、BYHYF剂量组、BYHYF高剂量组5组。对照组每周2次用橄榄油按3mL/Kg体重皮下注射，其他4组以40%CCl4(V/V，以橄榄油配制成)按3mL/Kg体重皮下注射，每周2次，首次加倍，均连续6周；在造模的同时，BYHYF低、中、高剂量组分别按11、22、44mg/（Kg体重·d）进行灌胃，连续6周；正常对照组和肝纤维化模型组则灌服等容量的0.9%NaCl，连续6周；所有大鼠予以普通大鼠饲料喂养，自由饮水。末次给药次日大鼠空腹3%戊巴比妥钠尾部静脉注射麻醉下处死大鼠并分离肝脏，部分肝组织10%中性甲醛固定后常规HE和Masson染色，观察肝组织炎症和纤维化；部分投入液氮中冻存，2～3h后移入-80℃冰箱用于基因和蛋白检测。Mst1、Yap、CTGF的mRNA的表达采用qRT-PCR技术，以β-actin为内参，相对表达量（2-ΔΔCt）表示目标基因相对表达量，引物由生工生物工程（上海）有限公司设计并合成，Mst上游引物：5’-TGAAGAGCTGGACTGTGGAGGAC-3，下游引物5’-GGATTGGCTGCCGCTTGGAG-3’，扩增片段：114bp；Yap上游引物：5’-GCCATGAACCAGAGGATCACTCAG-3’,下激引物：5’-AGCCTCTCCTTCTCCATCTGTAGC-3’；扩增片段152bp;CTGF上游引物：5’-CACCGCACAGAACCACCACAC-3’，下游引物：5’-GGCAGGCACAGGTCTTGATGAAC-3’，扩增片段96bp；β-actin上游引物：5’-TGTTGCCCTAGACTTCGAGCA-3’，下 游 引 物 5’-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3’，扩增片段155bp。采用全蛋白抽提试剂盒提取肝组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量，Western blot技术检测Mst1、Yap和CTGF蛋白表达及Yap的磷酸化表达，以GAPDH为内参。

2 结果

2.1 补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织病理影响：HE和Masson染色发现对照组肝组织结构正常，肝细胞从中央静脉呈索状排列，胶原着色仅见于血管壁；模型组大鼠肝组织大量炎细胞浸润、肝细胞脂肪变，小叶内肝细胞广泛坏死灶，胶原纤维增生进入小叶达中央静脉周围，小叶结构紊乱；与模型组比，BSHYF低、中、高剂量组大鼠肝组织炎细胞浸润和肝细胞坏死有不同程度改善，纤维结缔组织沉积显著减少，见图1。

2.2 补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织Mst1、Yap、CTGF基因mRNA表达的影响：模型组大鼠肝组织Mst1mRNA和Yap mRNA较对照组分别有下降和上调趋势，但均差异无显著性（P＞0.05）；BSHYF低、中、高剂量组Mst1 mRNA和Yap mRNA较模型组分别有上调和下降趋势，但差异无显著性（P＞0.05）。模型组CTGF mRNA表达较对照组显著升高（P＜0.01），BSHYF中、高剂量组大鼠CTGF mRNA表达较模型组显著下调（P＜0.01）。见图2。

图1 补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织病理影响

图2 补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织Mst1、Yap、CTGF基因mRNA表达的影响

2.3 补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织Mst1、Yap、CTGF蛋白表达的影响：模型组大鼠肝组织Mst1蛋白表达较对照组显著下降（P＜0.01），BSHYF高剂量组Mst1蛋白表达较模型组显著上调（P＜0.01）；模型组大鼠肝组织Yap、CTGF、蛋白表达较对照组显著上升（P＜0.01），BSHYF低、中、高剂量组Yap、CTGF蛋白表达较模型组显著下降（P＜0.01）；模型组大鼠肝组织Yap磷酸化水平与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），BSHYF低、中、高剂量组较模型组p-Yap磷酸化表达有上调趋势，但差异并无显著性（P＞0.05）。见图3。

图3 补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织Mst1、Yap、CTGF蛋白表达的影响

3 讨论

补肾化瘀方是课题组根据肝纤维化“本虚标实”的病机特点提出的治疗慢性肝纤维化的中药复方，具有补肾健脾以扶正，理气化瘀解毒以驱邪的功效，前期的研究已表明，该方改善CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织炎症和纤维化程度，保护肝细胞，防止肝纤维化进展[3-4]。本研究进一步从Hippo信号通路探讨其疗效的作用机制。

近年来研究发现Hippo信号通路可通过影响HSCs的转分化、增殖和凋亡，进而影响肝纤维化的发生及进展[5]。Mst1是该途径上游信号的核心组成部分，也是维持正常肝细胞状态的必要条件[6]。正常肝组织中Hippo通路的激活源于对Mst1磷酸化。磷酸化Mst1能直接磷酸化Lats1/2外，还能分别与支架蛋白Sav1、衔接蛋白Mob1结合间接促发Lats1/2磷酸化。活化的Lats1/2磷酸化Yap中的丝氨酸残基，导致p-Yap（Ser127）与14-3-3结合，使Yap泛素化、降解，阻碍Yap由细胞质转移到细胞核的途径，使Yap保留在细胞质中；位于细胞质中的Yap不能与核内TEAD结合，从而抑制了Yap转录活性[7]。当Hippo信号通路被抑制时，未磷酸化Yap可由细胞质向细胞核内积聚；移位至核内的Yap本身不与DNA结合，它可与多个转录因子（如TEAD）相互作用以驱动靶基因（如CTGF）表达[8]。Tadanors[9]等人发现Yap介导的肿瘤发生与Yap-TEAD介导的CTGF转录激活有关。多项研究发现Yap在HSCs早期活化期间出现大量细胞核内积累，抑制Yap可阻止HSCs纤维化生成[10]。CTGF是Yap下游效应因子，降低CTGF的表达可抑制HSCs的增殖与迁移[11]。因此，Hippo信号通路中Yap核质穿梭是调节TEAD活性，控制CTGF表达的关键；而CTGF也被认为是Yap在肝纤维化中的直接靶点。

本研究发现，肝纤维化模型组大鼠肝组织中Mst1蛋白表达较正常对照组明显下降（P＜0.01），Yap蛋白、CTGF mRNA及蛋白表达较对照组有明显上升（P＜0.05，P＜0.01），推测在早期肝损状态下，Hippo信号通路中上游信号Mst1对p-Yap的作用可能被抑制，促使Hippo信号通路激活，促进肝纤维化发生。应用补肾化瘀方干预后，高剂量组Mst1蛋白表达较模型组增强（P＜0.01），低、中、高剂量组Yap、CTGF蛋白表达以及中、高剂量组CTGF mRNA表达较模型组显著下降（P＜0.01），结合我们前期研究，发现不同剂量的补肾化瘀方能抑制肝纤维化大鼠肝组织α-SMA表达和HSCs的活化[3]。研究表明，补肾化瘀方对Hippo的上游信号Mst1、Yap的促进作用使得对核内靶基因的激活作用增强，这一系列反应最终导致Hippo信号通路的活化被抑制和纤维化程度被减弱。综上所述，补肾化瘀方可能对Hippo/Yap信号通路的激活起到抑制作用，进而抑制HSCs的活化，这可能是该方抗肝纤维化的作用机制之一。