益气养阴解毒方对胃癌前病变大鼠Th17/Treg平衡的影响

汤小芳 杨晴柔 陈芝芸 何蓓晖 严茂祥#

1 桐乡市第一人民医院 浙江 嘉兴 314505

2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

胃的癌前病变(PLGC)是正常胃黏膜发展到胃癌的重要阶段，积极干预胃癌前病变是降低胃癌发生率的有效措施。近年研究发现，胃癌的发生发展与辅助性T细胞17（Th17）/调节性T细胞（Treg）平衡失调而引起肿瘤细胞发生免疫逃逸相关[1]。笔者在临床上采用益气健脾、滋肝补肾、清热解毒为治疗原则的“益气养阴解毒方”治疗慢性萎缩性胃炎伴肠化/异型增生取得较好疗效[2-3]。为进一步探讨其作用机制，本研究采用新生大鼠短期灌服致癌剂诱导胃癌前病变模型，并以Th17/Treg平衡为切入点，阐述益气养阴解毒方防治胃癌前病变的免疫调节机理。

1 材料

1.1 动物：4～5周龄Sprague Dawley（SD）大鼠，雌性10只，雄性5只，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限公司【SCXK（沪）2012-0002】；在浙江中医药大学动物实验研究中心屏障环境中适应性喂养至2+月龄，以雌雄比2∶1进行配种，自由饮水采食，雌性大鼠怀孕后单笼喂养，选取出生3日的雄性乳鼠进行造模实验。

1.2 药物与试剂：益气养阴解毒方由黄芪、党参、熟地、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、丹皮、白花蛇舌草、仙鹤草、莪术组成，按 2∶1.5∶2∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶2.5∶2.5∶2.5∶1比例，由浙江中医药大学附属第一医院制剂室制成流浸膏，每毫升含生药2.565g。1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG）由东京化成工业株式会社提供；Bio-Plex EXP Rat Cyto Group Kit、Bio-Plex ProTMRat IL17A、IL-6、IL10 Standard、Bio-Plex ProTMRat TGF-β1 Standard由美国Bio-Red公司提供；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司提供；CHamQTM SYBRR qPCR Master Mix由南京诺唯赞生物科技有限公司提供；总蛋白提取试剂盒、BCA定量试剂盒由江苏凯基生物技术股份有限公司提供。

1.3 主要仪器：Bio-Rad CFX Touch荧光定量PCR仪、Bio-Plex 200液相悬浮芯片系统，美国Bio-Red公司；Bertin Precellys-24生物样品均质器为法国Bertin Technologies公司；Thermo Varioskan Flash全波长酶标仪，美国THERMO Electron公司。

2 方法

2.1 分组及处理：出生3d雄性乳鼠52只分为正常组14只，造模组38只。各乳鼠均与母鼠同养，常规母乳喂养，每日上午各乳鼠禁食2h后正常组灌胃生理盐水、造模组灌服800μg/ml的MNNG，均0.1ml/只，连续10d；所有乳鼠于3周龄断乳并分笼，常规自由饮食和饮水。以灌胃MNNG结束次日为观察第1天，第22周末两组各处理大鼠6只，空腹麻醉下处死，分离胃组织，沿胃大弯剖开，用生理盐水冲洗，中性甲醛固定，HE染色观察胃黏膜病理变化。剩余造模组24只大鼠随机分为模型组、中药高剂量组、中药低剂量组，每组8只，剩余正常组8只仍为正常组；第23周起，正常组、模型组每天灌服0.9%NaCl溶液10ml/kg，中药高、低剂量组每天分别灌服25.65g/kg、8.55g/kg的益气养阴解毒方流浸膏，均连续用药12周后，按上述方法处理大鼠，收集胃组织标本，观察胃黏膜肉眼变化，取胃窦至胃体长条组织在中性甲醛中固定用于病理观察，其余胃组织-75℃待用。

2.2 检测指标：胃黏膜病理学检测采用HE染色，参考中国慢性胃炎共识（2012年，上海）[4]和异型增生病变Pavoda国际分级标准[5]，光镜下观察胃黏膜炎症、萎缩、肠化、异型增生、腺瘤等情况。胃黏膜FoxP3mRNA、RORγt mRNA表达采用qRT-PCR法检测，引物由生工生物工程(上海)有限公司设计合成，FoxP3上游引物：5'-ACT GCC AAG CAG ATC ACC TC-3’，下游引物：5'-CTG CAT AGC TCC CAG CTT CT-3’，扩增片段：122bp；RORγt上游引物：5'-GAG GCC ATT CAG TAC GTG GT-3’，下游引物：5'-CTG ACG AGG ACG ACT TCC AT-3’，扩增片段：116bp；β-actin上游引物：5'-TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3’，下游引物：5'-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3’，扩增片段：155bp。采用总蛋白提取试剂盒提取胃黏膜蛋白，以BCA法定量胃黏膜总蛋白浓度，采用液相悬浮芯片技术检测血清和胃黏膜白介素-17（IL-17A）、白介素-6（IL-6）、转化生长因子-β（TGF-β）、白介素-10（IL-10）等水平。

3 结果

3.1 益气养阴解毒方对胃癌前病变大鼠胃黏膜病理影响：HE染色光镜观察发现，正常组大鼠胃黏膜上皮细胞完整，腺体排列整齐、规则，细胞核位于基底部。造模后22周末所有大鼠可见胃黏膜有淋巴细胞和浆细胞等炎细胞的浸润，半数大鼠腺体略减少，排列稍紊乱，个别细胞腺体囊状扩张，并出现轻度异型增生，所有大鼠胃黏膜肠上皮化生均不明显；至造模后35周实验结束，模型组大鼠胃黏膜炎细胞浸润明显，腺体排列紊乱加重，8例大鼠均有低或高级别异型增生，其中2例还可见高分化腺癌形成；仍未见明显肠上皮化生。各药物干预组大鼠胃黏膜也可见炎细胞浸润，部分大鼠胃黏膜腺体稍减少，排列有紊乱，个别细胞腺体囊状扩张及异型增生，以低级或不确定为主，见图1。35周模型组大鼠胃黏膜炎症、萎缩及异型增生等积分较正常组明显增高（P＜0.05、P＜0.01），中药低、高剂量组炎症程度较模型组明显降低（P＜0.05、P＜0.01），萎缩程度与模型组比差异无统计学意义（P＞0.05）；异型增生等程度较模型组明显减轻（P＜0.05、P＜0.01）。见表1～表3。

图1 大鼠胃黏膜病理（HE×100）

表1 各组大鼠胃黏膜炎症程度比较（n=8,例）

表2 各组大鼠胃黏膜萎缩程度比较（n=8,例）

表3 各组大鼠胃黏膜癌前病变的比较（n=8,例）

3.2 益气养阴解毒方对胃癌前病变大鼠胃黏膜RORγt、FoxP3mRNA表达的影响：模型组大鼠胃黏膜RORγtmRNA表达、RORγt/FoxP3比值较正常组显著增强(P＜0.01)，FoxP3mRNA则与正常组比差异无统计学意义(P＞0.05)，中药低、高剂量组RORγtmRNA表达、RORγt/FoxP3比值较模型组明显下降（P＜0.01、P＜0.05）。见图2。

图2 大鼠胃黏膜RORrt、FOXp3mRNA表达及比值（n=8）

图3 各组大鼠血清IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10水平（n=8）

图4 各组大鼠胃黏膜蛋白提取液IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10水平（n=8）

3.3 益气养阴解毒方对胃癌前病变大鼠血清、胃黏膜IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β水平的影响：与正常组相比，模型组血清IL-17A、TGF-β和IL-6含量和胃黏膜IL-17A、TGF-β含量均显著增高(P＜0.05、P＜0.01)；与模型组比，中药高、低剂量组血清IL-17A、IL-6和TGF-β含量、胃黏膜IL-17A、TGF-β含量以及中药高剂量组血清TGF-β含量明显降低(P＜0.01、P＜0.05)。见图3～图4。

4 讨论

胃黏膜萎缩伴肠上皮化生或异型增生属于胃癌前病变。根据其临床表现，可归属于中医学“胃痛”“痞满”等范畴；主要病机是脾胃虚弱、肝肾亏损、热毒邪结。据此，笔者创立益气养阴解毒方。方中黄芪、党参补中益气；熟地、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、丹皮滋补肝肾；白花蛇舌草、仙鹤草、莪术清热理气解毒。诸药共奏益气健脾、滋肝补肾、清热解毒之功。

本研究发现，益气补肾解毒方能减轻炎症细胞的浸润，改善或逆转大鼠胃黏膜异型增生，阻止胃癌前病变的进展，尤以高剂量效果明显。与正常组相比，模型组大鼠 胃 黏 膜 RORγtmRNA表 达 上 调 、RORγtmRNA/FoxP3mRNA比值增高(P＜0.01)，血清和胃黏膜IL-17A和TGF-β水平以及胃黏膜IL-6水平均明显增高(P＜0.01、P＜0.05)，提示新生大鼠短期灌服致癌剂MNNG诱导的胃癌前病变模型大鼠胃黏膜局部微环境发生了变化，促炎因子分泌增加，存在着Th17/Treg免疫失衡。益气补肾解毒方干预后，大鼠胃黏膜组织RORγtmRNA表达下调、RORγt/FoxP3比值下降，血清和胃黏膜蛋白提取液IL-17A、TGF-β水平和胃黏膜蛋白提取液IL-6水平降低；表明通过调控RORγt、Foxp3等转录因子表达以及炎症因子IL-17A、IL-6、TGF-β的水平，该方能一定程度纠正Th17/Treg失衡进而缓解减轻或逆转胃黏膜炎症及异型增生。