Hp感染根除治疗前后慢性胃炎胃黏膜组织中miR-22和NLRP3炎症小体表达水平变化分析

陈梦娜 李善高*

幽门螺杆菌（Hp）是一种革兰阴性微需氧致病菌，可引起慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关组织淋巴瘤等疾病［1］。1994年，世界卫生组织（WHO）下的国际癌症研究机构（IARC）将Hp定义为胃癌I类致病物［2］。我国目前Hp感染率高达50%，含铋剂四联已作为主要的经验性根除Hp方案，随着多种抗生素的高耐药率，Hp根除已成为临床中的巨大挑战，其具体机制尚待进一步证实。作者通过测定不同Hp感染程度的慢性胃炎患者杀菌前后的胃黏膜组织中miR-22和NLRP3炎症小体表达水平变化，初步探讨miR-22及NLRP3炎症小体在Hp感染致病中的作用，为Hp相关性疾病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月至2019年3月浙江省中医院内镜中心慢性胃炎患者105例，其中Hp感染阳性组患者85例，男49例，女36例，年龄20～60岁。根据感染程度分为轻度（+）18例、中度（++）22例、重度（+++）45例；阴性组20例作为对照组，男11例，女9例；年龄20～60岁。（1）纳入标准：①Hp感染患者14C-尿素呼气试验及病理组织HE染色结果均阳性；②近期血液有关指标如血常规、肝肾功能及凝血类等均无明显异常；③无Hp根除治疗经历；④意识清楚，无认知障碍等；（2）排除标准：①近1个月内未曾使用抗生素、PPI、非甾体类药物、大剂量激素、免疫抑制剂等；②严重药物过敏史、孕妇、哺乳期妇女、药瘾者、酗酒者等；③活动性溃疡、胃大部切除史、胃肠道恶性肿瘤等患者，严重心、脑、肝、肾功能不全，风湿免疫系统疾病，内分泌系统疾病，血液系统疾病，神经精神性疾病等。本项目经浙江省中医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法 （1）14C-尿素呼气试验：患者保持清晨空腹，检测前漱口，通过温凉饮用水（20ml）服用1粒尿素14C胶囊，静坐15～20min左右，取出呼气卡，沿呼气口向卡内呼气1～3min，期间允许换气，忌吸气，直至卡上指示窗颜色由橙红色变成黄色为止。将呼气卡检测窗口上的封签揭去，插入HUBT-20型幽门螺杆菌测试仪，待仪器自动对标本进行检测，结果以每分钟衰变数（DPM/mmol）表示。评判标准：阴性：DPM＜100；阳性：DPM≥100。（2）胃黏膜组织标本采集：所有研究对象均行胃镜检查，临床医师在胃镜下使用活检钳钳取胃窦部位的胃黏膜组织至少2块，每块组织大小约0.2cm×0.2cm，其中1块胃黏膜组织标本固定于10%福尔马林中，另1块立即于-80℃冰箱内冷藏备用。（3）HE染色：取出在10%福尔马林中固定的胃黏膜组织，冲洗干净后依次放入低浓度和高浓度的乙醇中脱水处理，加入二甲苯进行透明处理，充分替换出残留在其中的乙醇。后将标本放入石蜡块中包埋，用切片机小心切成每片厚度约为4µm的薄片，再次加入二甲苯脱蜡处理，经高浓度和低浓度的乙醇及蒸馏水处理好的切片中加入苏木精染色溶液染色15min，在盐酸和氨水中各分色几秒钟，用蒸馏水冲洗干净后加入伊红酒精染色3min，分别使用100%乙醇和二甲苯进行脱水透明，并加入中性树胶，放上盖玻片封固，放置于烤箱内将其烘干，使用电子显微镜观察胃黏膜组织病理形态改变，并拍照保存。通过在高倍显微镜下对胃黏膜组织进行观察，对Hp感染程度进行分组，评判标准［3］：切片上未见Hp菌体表示无Hp感染；见菌株分布小于标本全长的1/3区域表示轻度Hp感染（+）；＞1/3标本全长，＜2/3区域表示中度Hp感染（++）；Hp菌株成堆存在，基本分布于标本全长表示重度Hp感染（+++）。（4）RT-PCR测定 miR-22，NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表 达 水平：将置于-80℃冰箱中的胃黏膜组织取出，Trizol法提取总RNA，取总RNA 1µg，以细胞总RNA为模板，逆转录cDNA，制成20µl逆转录体系；以1.0µl DNA作为底物进行Real-time PCR：在96X PCR板各空中加入1.0µl cDNA、5xSYBR mix以及目的条带引物，总反应体系为20µl，置于荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后，95℃ 15s→63℃ 25s（收集荧光），40cycles，之后进行溶解曲线实验，检测是否含有非特异性条带扩增。各个基因的相对表达水平以2（Ct内参基因-Ct目的基因）进行统计分析。（5）Western blot测定胃黏膜组织中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达水平：将胃黏膜组织置于1～2ml匀浆器中，经PBS洗涤后，用剪刀将其剪碎，向其中添加总蛋白提取试剂静置裂解30min后，将裂解液移至1.5ml EP管中，然后在4℃，12000rpm离心15min，取上清液分装于1.5ml EP管中并置于-20℃保存。后经上样、电泳、转膜、染色、去离子水震荡去除浮色，放入含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。将一抗用TBST稀释至适当浓度，在4℃下孵育过夜，同上方法准备二抗稀释液并与PVDF膜接触，室温下孵育1h，洗涤后加入底物孵育，取出硝酸纤维素膜，蒸馏水漂洗后晾干，通过在暗盒中进行约10min的曝光来完成显影和定影。使用Image J软件分析每个条带的光密度，并重复进行3次，靶蛋白的相对表达＝［靶蛋白（光密度值）/内部参数（光密度值）］×10n。阳性组患者具体服药方案：泮托拉唑40mg+果胶铋100mg，2次/d，餐前30min口服；阿莫西林1000mg+克拉霉素500mg，2次/d，餐后口服。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。正态分布计量资料以（±s）表示，各组比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 所有阳性组患者均严格服用四联杀菌药物14d，疗程结束1个月后再次接受14C-尿素呼气试验及胃镜检查，服药期间无明显身体不适，饮食生活规律（最后因各种原因失访10例）。患者Hp根除率为90.67%，与国内相关指南及共识提出的根除率＞90% 一致［8］。

2.2 RT-PCR测 定 胃 黏 膜 组 织 miR-22、NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达水平 根除治疗前，Hp感染阴性组、轻度感染治疗组、中度感染治疗组及重度感染治疗组的miR-22表达水平分别为（8.46±0.09）、（5.16±0.11）、（4.35±0.06）、（3.27±0.03）；NLRP3 mRNA表达水平分别为（5.26±0.07）、（9.87±0.03）、（10.66±0.09）、（12.02±0.06）；ASC mRNA 表达水平分 别 为（6.46±0.7）、（8.97±0.05）、（9.96±0.07）、（11.09±0.10）；Caspase-1 mRNA 表 达 水 平 分 别为（4.68±0.12）、（6.15±0.06）、（6.83±0.06）、（7.89±0.03），组间差异均有统计学意义（P＜0.05）；Hp感染程度越高，miR-22表达水平越低，NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表达水平越高（P＜0.05）。在根除治疗成功组中，轻度治疗组、中度治疗组及重度治疗组的miR-22表达水平分别为（5.93±0.04）、（5.1±0.05）、（4.44±0.06）；NLRP3 mRNA 表达水平分别为（8.76±0.12）、（9.22±0.04）、（0.96±0.09）1；ASC mRNA 表达水平分别为（7.65±0.05）、（8.7±0.08）、（10.01±0.10）；Caspase-1 mRNA表 达 水 平 分 别 为（5.52±0.07）、（6.01±0.11）、（6.88±0.14）， 较 各 组杀菌前比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。在根除治疗失败组，胃黏膜组织中miR-22及NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表达水平在根除治疗前后无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 Western blot测定胃黏膜组织中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平 根除治疗前，Hp感染阴性组、轻度治疗组、中度治疗组及重度治疗组的NLRP3蛋白表达水平分别为（1.95±0.08）、（6.84±0.09）、（9.84±0.07）、（12.56±0.09）；ASC蛋白表达水平分别为（2.33±0.11）、（7.81±0.07）、（18.36±0.1）、（23.56±0.1）；Caspase-1蛋白表达水平分别为（2.94±0.09）、（16.05±0.08）、（20.33±0.09）、（25.52±0.1），组间差异均有统计学意义（P＜0.05）；Hp感染程度越高，其表达水平也越高（P＜0.05）。在根除治疗成功组中，轻度治疗组、中度治疗组及重度治疗组的NLRP3蛋白表达水平分别为（3.75±0.1）、（6.27±0.1）、（8.27±0.08）；ASC蛋白表达水平分别为（3.64±0.08）、（13.58±0.09）、（16.54±0.08）；Caspase-1蛋 白 表 达 水 平 分 别 为（7.67±0.11）、（11.84±0.09）、（18.32±0.09），较各组杀菌前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。在根除治疗失败组，胃黏膜组织中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平在根除治疗前后差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

Hp最早于1893年由意大利病理学家Bizzozero首次在动物胃内发现［4］，作为唯一可存活于胃内的细菌，具有严重的致病性，借助特有的毒力因子，长期定植于宿主体内，引起一系列Hp相关性疾病［5］。有研究表明，Hp感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病原因，并且经历从慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、不典型增生到胃癌的病理演变过程，且在此过程中不同阶段Hp阳性率也有所差异［6］。我国Hp感染率约为50%～90%，高于发达国家平均水平（50%～70%），且Hp感染率在不同年龄阶段、种族、信仰以及受教育程度中存在显著差异［7］。目前主要推荐含铋剂四联作为主要的根除治疗Hp方案［8］。近年来，随着抗菌药物的广泛使用，我国Hp对较多抗生素产生耐药，明显降低根除治疗率［9］。因此，迫切需寻求一种高效、且副作用小的根除Hp的药物。

miRNA是近年来发现的一类长18-26个核苷酸的高度保守的小分子RNA，其几乎可以完全互补靶mRNA 的 3'UTRs（3'Untranslated regions，3'非 编 码区），并在转录水平上发挥降解作用；也可以与之不完全互补，在翻译水平上抑制蛋白质的合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用［10］。成熟miRNA通常先通过RNA聚合酶II从相应的基因组DNA转录成初级miRNA，再由核酶进一步切割而成［11］。越来越多的研究表明，细菌和病毒感染均可影响哺乳动物和植物细胞中miRNA的表达过程［12］。NLRP3炎症小体是目前研究较多的炎症小体，其受体蛋白是NOD样受体蛋白3，属于NLRs家族，NLRs家族由N端的Caspase募集和活化结构域或热蛋白结构域（PYD）、C端富含亮氨酸的重复序列和中间的NACHT结构域（NOD结构域）3部分组成。NLRP3炎症小体是由NOD样受体蛋白3（NLRP3）、凋亡相关的斑点样蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）所组成蛋白复合物。其在激活后可通过Caspase-1水解前体IL-1β（pro-IL-1β）、前体IL-18（pro-IL-18）和gasdermin D，使其形成并释放具有活性的IL-1β、IL-18和gasdermin D的N端片段，被多种病原相关的分子模式或损伤相关的分子模式活化，在固有免疫系统的免疫调节过程中发挥重要作用［13-15］。有研究以Hp联合N-甲基-N-亚硝酸脲（MNU）灌胃小鼠胃癌模型为对象［16］，结果显示Hp感染组织中miR-22表达抑制，而对NLRP3的抑制减弱，诱发NLRP3炎症小体聚集及激活，导致巨噬细胞产生大量的IL-1β。大量研究也表明，NLRP3是miR-22的直接靶点，NLRP3炎症小体在Hp感染致炎过程中发挥重要作用。针对miR-22、NLRP3炎症小体在人Hp感染致炎过程中所发生的作用，目前国内外尚无相关文献报道。

本资料结果显示，Hp阳性组胃黏膜组织中miR-22表达水平低于阴性组，而NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平高于阴性组；在成功根除治疗后，miR-22表达水平较前升高，NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平较前降低。基于本次实验结果，作者推测NLRP3炎症小体对胃黏膜具有致炎作用，而miR-22起到抑制炎症的作用，在Hp感染过程中，可能是通过抑制miR-22的表达，参与激活NLRP3炎症小体信号通路，致使大量炎症因子释放，从而导致胃黏膜的持续性病理损伤。但其如何导致胃黏膜炎症改变的具体机制还需进一步探索，明确此作用的关系可能为临床中Hp相关性疾病的防治过程提供理论基础。