BCG表面糖脂的分离与纯化鉴定

2020-12-20詹红伟刘鉴霄张正衍王嘉琪王东鑫

临床医药文献杂志(电子版) 2020年48期

詹红伟*，刘鉴霄*，刘昊，张正衍，姚远，张颖，王嘉琪，王东鑫

(1.兰州大学第二临床医学院，甘肃兰州 730030；2.兰州大学第一临床医学院，甘肃兰州 730000)

1 研究方法

1.1 制备培养基

苏通培养基(1000m1):硫酸镁0.5 g；柠檬酸2 g；磷酸氢二钾0.8 g；L-谷氨酸钠5 g；柠檬酸铁胺0.05 g；甘油60 mL，硫酸锌0.01 g。加超纯水溶解完全，氨水调PH至7.2～7.4，分装至500 mL三角瓶及200 ml/瓶。

1.2 接种BCG

取活化后的菌种，取适量菌液分别接种到500m1及250ml的苏通培养基中，衡温培养至培养基的液面富集一定厚度的菌体层。将培养基中菌体进行抽滤收集，后用PBS溶液洗涤两次，置于试管中在4℃冰箱中进行保存。

1.3 BCG表面糖脂萃取

1.3.1 摇床

事先将所需的锥形瓶、玻璃珠以及混合液（氯仿：甲醇=2：1）进行高压蒸汽灭菌，将试管中所收集的菌体置于已灭菌的锥形瓶，每个250ml锥形瓶中加入4 g菌体，20g玻璃珠以及100ml的混合溶液，以上所有操作均在无菌操作台中完成。以8种方案进行糖脂提取：摇床转速：方案一：100 rpm；二：150 rpm；三：200 rpm；四：250 rpm；五：100 rpm；六：150 rpm；七：200 rpm；八：250 rpm。摇床时间一至四为5 min；五至八为2 min。离心转速各为5000rpm。离心时间各为10 min。

1.3.2 离心

装入50 mL的离心管中，并且用天平配平使试管质量相近，后进行以5000rpm离心10min，使菌体与糖脂分层，收集上清液。

1.3.3 旋转蒸发仪浓缩上清液

将离心后的上清液以10X、15X、20X浓缩，置于10 mL试管中。将试管置于-20℃冰箱中保存。经薄层色谱染色分析，20倍浓缩。

1.4 BCG表面糖脂的纯化

1.4.1 过柱前薄层色谱法分析：用微量移液器量取10 uL在硅胶板上进行点状点样，将硅胶板斜放入层析缸中，用氯仿:甲醇:丙酮:乙酸((90:10:6:1)展开剂展开，当展开剂前缘距硅胶板上端1 cm处，取出硅胶板吹干。

1.4.2 硅胶柱层析法纯化

称取l00 g 200～300目硅胶粉末，用300 mL氯仿浸泡过夜;匀浆湿法装柱，调整流速，并使用250 mL～500 mL的氯仿平衡硅胶柱。

取5 mL上清液进行上样，以氯仿/甲醇混合液为流动相，在不同比例氯仿/甲醇梯度洗脱条件下分离总脂，柱层析流速控制在1ml/min。以三种洗脱液进行糖脂的洗脱：

①氯仿:甲醇99:1；②氯仿:甲醇9:1；③氯仿:甲醇，96:4

1.4.3 过柱后薄层色谱法分析

将洗脱产物在10xl0 cm规格硅胶板上点样，点样为9 cm左右线状，待样品干燥后，斜放入层析缸中，用氯仿:甲醇:丙酮:乙酸((90:10:6:1)展开剂展开，当展开剂前缘距硅胶板上端1cm处，取出硅胶板吹干，进行碘染，观察染色效果，并于之前洗脱前染色结果进行对比。

2 结果与分析

2.1 总脂萃取结果

BCG大量培养后，收集菌体，并使用高速离心机分离糖脂和菌体，取上清液，将离心后的上清液置于旋转蒸发仪中浓缩至10X，15X，20X，再经薄层色谱染色分析，得出20X浓缩染色效果最佳。根据硅胶板上条带数可观察出浓缩后的上清液均有较多成分且含量不一，经过对比发现方案二（150 rpm 5 min）的所取得的粗糖脂成分相对较少，可做为后期备选方案。

2.2 糖脂的分离纯化结果

硅胶经过氯仿浸泡过夜充分溶胀后，均匀装柱（柱长30 cm，直径2 cm），过程中持续用玻璃棒敲打防止气泡产生，调整流速1ml/min，总脂（溶剂为甲醇：氯仿=1：2）上样5ml左右，依次用50ml氯仿：甲醇=99：1，50ml氯仿：甲醇=9：1，50ml氯仿：甲醇=96:4的有机体系进行洗脱，收集洗脱液，将方案二的于其余薄层色谱分析图进行对比，其成分相对较少，并且仅有经过洗脱液（氯仿：甲醇=9:1）过柱后显示明显条带，其余方案过柱后的三种洗脱液均有不同程度的显带，且条带数较多，说明其洗脱液成分相对较多，其次再根据总脂萃取结果可大致认为方案二的BCG糖脂纯化方法较优于其他方案。

2.4 糖脂成分分析

为了检测过柱后洗脱液是否存在核酸和蛋白质等杂质，我们将硅胶柱层析所得24种洗脱液进行核酸电泳凝胶分析和蛋白质凝胶电泳分析。

2.4.1 核酸凝胶电泳分析结果

24种洗脱液经核酸凝胶电泳分析并进行凝胶摄影后得出，图中荧光亮点即为核酸所在位置，可观察到第1、6、8、9、15、20、21号试管中有荧光出现，故可分析出方案一、方案三、方案五、方案七中经过柱的洗脱液均含核酸杂质，又根据其核酸所在位置与DL 15000 DNA Ladder标准条带位置对比，可观察出洗脱液中核酸分子量较大，结核分歧杆菌的全基因组序列约为4.41Mb，有3942个开放阅读框，约4000个基因；在实验方案中可能由于转速过高使玻璃珠对菌体的破坏较大，使菌体破裂释放出核酸分子，后者被EB染色，在紫外光下可发出荧光，且核酸凝胶电泳仅可分离长度为200dp至50kb的核酸分子，这可以解释凝胶摄影所出现的核酸位置仅在点样部位的现象。

2.4.2 SDS-PAGE分析结果

24种洗脱液经蛋白质凝胶电泳分析后拍摄后得出，将24种洗脱液和标准蛋白样所跑条带进行对比，可发现24种洗脱液均无蛋白条带出现，因此初步确定24种洗脱液中无蛋白质杂质。

3 讨论

本实验通过自己创新性提脂方法和前人纯化方法相结合，我们从BCG菌体中分离出来了部分糖脂，早期预实验用PBS作为提取糖脂的溶液，但运用旋转蒸发仪进行上清液浓缩时，在不破坏糖脂内部结构的情况下进行蒸发，温度控制在了60度，但PBS缓冲溶液的沸点远远比其高得多，故无法将PBS进行浓缩，于是想到了高压冷冻浓缩仪，我们准备将提取粗糖脂的溶液改为PBS溶液进行，若分离效果明显，可将浓缩后的上清液进行再次浓缩至1ml，待自然挥发干燥后免疫小鼠，通过检测小鼠血清中结核杆菌相关IgG类抗体产生情况来进一步对其免疫活性进行研究，若免疫活性较为理想，该糖脂可有望成为亚单位疫苗的新型佐剂，为亚单位疫苗的研究提供了理论和物质基础。