自身免疫性肝炎自身抗体的研究进展

张海萍， 闫惠平

首都医科大学附属北京佑安医院 临床检验中心， 自身免疫性肝病临床研究中心， 北京 100069

自身免疫的血清学检测是诊断和治疗自身免疫疾病的关键指标。在国内外自身免疫性肝炎(AIH)指南或共识中，自身抗体都是不可或缺的诊断指标之一[1-2]。利用自身抗体的靶抗原进行动物实验或体外实验研究是认识AIH发病机制的重要途径。自身抗体不同于其他种类的检验项目，其特殊性在于：某些自身抗体的方法学对于结果的判断和临床意义的认识可以产生较大影响；出现于AIH的自身抗体种类较多，而且大部分患者检测到的自身抗体对疾病都缺乏特异性；自身抗体也存在于病毒性肝炎和其他常见肝病中。因此在诊断AIH之前正确地理解和判断自身抗体结果的临床意义是很重要的。

参考自身抗体结果，AIH一般分为1型和2型两种临床型[3]。与AIH-1型相关的自身抗体主要包括：抗核抗体(ANA)、抗平滑肌抗体(anti-smooth muscle antibody，ASMA)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(anti-soluble liver antigen and liver pancreas antigen, anti-SLA/LP, 以下简称抗-SLA)和抗中性粒细胞抗体(anti-neutrophil cytoplastic antibody, ANCA)；与AIH-2型相关的自身抗体主要包括：抗肝肾微粒体抗体(anti-liver kidney microsomal antibody，抗-LKM)和抗肝细胞溶质抗原抗体-1(anti-liver cytosol type 1，抗-LC1)。本文将对自身抗体的基本检测方法简单评价，并简介AIH的主要自身抗体。

1 相关指南对自身免疫性肝病主要自身抗体检测方法的推荐意见

临床医生应了解自身抗体的检测方法。自身抗体和免疫球蛋白是诊断自身免疫性肝病的关键指标，正确认识自身抗体的意义需要对用于自身抗体检测的实验室基本技术知识有所了解。

1.1 基本检测方法 ANA总抗体的检测方法依然推荐以HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞系)作为基质、间接免疫荧光法(indirect immune fluorescent assay, IIF)检测[4-5]；肝脏相关的其他自身抗体，如ASMA，以啮齿类动物组织为基质、IIF法仍然是筛查的“金标准”。虽然IIF方法存在明显不足，例如，该法采用的血清稀释体系国内各医疗机构不统一，导致检验结果不能互认；其结果的判读与技术人员水平、仪器等多因素有关。在许多检验项目中早已被其他方法学取代，但是在自身抗体检测中，当前仍不可或缺[6]。目前，基于纯化蛋白或重组抗原的检测方法越来越多地被使用，主要优点是不受观察者的人为因素影响，但局限性是只能检测到已被确定自身抗原靶点的自身抗体。已经广泛用于临床的方法如，免疫印迹法(IB或WB)、ELISA及化学发光法、流式荧光法等，其中一些具有自动化程度较高、操作易于标准化等优势，可能成为这一领域的技术发展趋势。

1.2 指南推荐的方法 欧洲肝病学会(EASL)AIH指南中强调：IIF法是除抗-SLA外所有AIH相关自身抗体常规检测的首选和主要技术[2]。ANA、ASMA、抗-LKM-1和抗-LC1可以联合检测(如果抗-LKM-1阴性，还可以检测LKM-3)。IIF法检测肝脏自身抗体应在新鲜冰冻的啮齿动物基质上进行，通常包括肾脏、肝脏和胃。在原发性胆汁性胆管炎(PBC)的指南[7]中推荐，对不能解释原因的所有胆汁淤积病例，建议采用IIF法进行血清抗线粒体抗体(AMA)和PBC特异性ANA的筛查。而对AIH唯一具有诊断特异性的抗-SLA，由于缺乏典型荧光图形而不推荐IIF法检测。其确切的靶抗原已在分子水平上鉴定，并用于固相分析，因此推荐ELISA或免疫印迹方法(IB或WB)检测抗-SLA。

2 AIH的主要自身抗体

2.1 抗核抗体(ANA)

是各种自身免疫疾病首选检验项目，最常见阳性但临床意义最复杂多样。

2.1.1 ANA在肝脏疾病中的检出率 ANA是AIH最常见的自身抗体，是AIH-1型的诊断标志之一。在北美白人中，AIH的成年患者发病时80%可以检测到ANA[3]，在欧洲50%～70%的AIH患者ANA阳性[2]，在我国70%～80%的AIH患者呈ANA阳性，ANA和(或)ASMA阳性者可达80%～90%[1]。但遗憾的是，这种最高检出率的自身抗体对AIH的诊断并不是特异性的。依据AIH的诊断评分系统，ANA阳性的肝病患者需要先排除病毒性肝病等疾病，再结合血清IgG和肝组织学改变等特征才可以确诊AIH[8-9]。 此外，疑似药物性肝损伤的患者也可能出现ANA，或实为药物诱导的AIH，需要谨慎做出鉴别诊断[6]。ANA在PBC患者中常以特征性的形式出现(抗gp210或抗sp100阳性，或荧光核型)，称为PBC特异性ANA。ANA也可在原发性硬化性胆管炎(PSC)(29%)、慢性丙型肝炎(26%)、慢性乙型肝炎(32%)、非酒精性脂肪性肝病(34%)和慢性酒精性肝病(21%)中出现。在AIH以外的肝脏疾病中，ANA和ASMA同时出现的比例小于10%，如果同时出现两种自身抗体，则AIH的诊断准确率从58%提高到74%[3]。

2.1.2 ANA的荧光核型 判读IIF法ANA检验报告的临床意义，主要依据其荧光核型和抗体滴度[10]。荧光核型是指采用HEp-2细胞为基质，IIF检测ANA时，由于ANA的靶抗原性质或位置的不同，在荧光显微镜下观察到的形态各异的荧光图形。核型的分类可以依据“ANA核型的国际共识”[5]中的描述来报告：例如，位于细胞核的核型有核均质型、核颗粒型、着丝点型、核仁型等；位于细胞浆的核型有胞浆颗粒型、高尔基体型、溶酶体型等。AIH患者的ANA可表现为核均质型、核颗粒型、核仁型或混合核型，提示其靶抗原可能为染色质、双链DNA、核糖体蛋白等。但这些荧光核型均不是AIH诊断特异性的核型。例如，核均质型在系统性红斑狼疮比较常见，是临床需要鉴别的问题。相比之下，PBC的ANA具有特征性的核型，辅助诊断的作用要强很多：例如，核周型(或称核膜型)及核点型ANA对PBC具有诊断特异性，被称为PBC特异性ANA。由于人类肉眼分辨和判断核型的能力有限，而目前基于计算机软件的图像分析系统判断核型的能力也有诸多局限性，这是造成临床ANA结果不一致的重要原因之一。

2.1.3 ANA滴度 ANA滴度对疾病诊断有重要价值，在自身免疫疾病时多表现高滴度阳性，而在病毒性肝炎、药物性肝损伤等情况下可能低滴度阳性。如何判断抗体滴度的高低？1∶160与1∶320孰高孰低？答案不能一概而论。目前国内许多医院与国外采用试剂不同，而国内IIF检测自身抗体主要有两种稀释体系，各个医院采用试剂的检测稀释体系不同，可能会导致同一份样本在A医院报告1∶160阳性，而在B医院报告1∶1000阳性。因此，不同医院的ANA结果主要依据自己的参考范围，不同稀释体系之间的结果目前还难以互认。

2.2 抗平滑肌抗体(ASMA) ASMA与ANA均为AIH-1型的主要诊断标志，约半数ANA阳性的病例与ASMA有关。在欧洲AIH患者中50%～70%可检测到ASMA，北美AIH患者中约63%出现ASMA，但国内报道阳性率多低于欧美国家，仅有20%～30%的AIH患者呈ASMA阳性[1]。而且，ASMA还常常在病毒性肝炎患者血清中检测到。后者的特点是抗体滴度一般较低，且有可能在一段时间内阴转。在美国，ASMA可作为PSC(6%)、慢性丙型肝炎(6%)和慢性酒精性肝病(4%)的单独血清学指标出现[3]。

指南推荐采用IIF方法，以哺乳动物的胃、肾等组织作为基质检测ASMA[2]。ASMA在荧光显微镜下显示不同的染色模式：血管/肾小球和血管/肾小球/肾小管模式被认为是对AIH诊断具有特异性的，而仅有血管模式的情况可在多种疾病中发现[11]。笔者牵头在2018年依托两个学会组织进行了“全国自身免疫性肝病相关自身抗体检测室间质量调查”活动，参与调查的138家医疗机构(来自全国27个省、自治区和直辖市，以三级以上医疗机构为主体)回报的结果提示，ASMA检测全部采用IIF，与国际指南推荐方法一致。Shibuki等[12]报告，根据国际自身免疫性肝炎组织(International Autoimmune Hepatitis Group, IAIHG)提出的修订评分系统，回顾分析了2009年-2014年在Saga肝病研究组的4家医院诊断为AIH-1型的53例患者的病历，所有患者治疗后均获得缓解，9例(17%)随后复发。复发患者具有明显年轻，ASMA阳性率高于未复发患者(100% vs 25%，P=0.001 2)的特点。而ANA滴度与复发率无关。提示ASMA是AIH-1型患者停药期间或停药后复发的一个预测指标；对高滴度ASMA患者应注意免疫抑制治疗的随访。

2.3 抗肌动蛋白抗体(抗-actin) ASMA的靶抗原是细胞骨架成分，包括微丝、微管和中间丝，而微丝中主要是肌动蛋白，后者又可分为G-肌动蛋白和F-肌动蛋白。高滴度F-肌动蛋白抗体对诊断AIH-1的特异性较高。其与ASMA同时检测或采用ELISA方法(定量)检测，可有助于提高AIH的诊断率。曾有研究[13]显示，ASMA(>1∶80)和抗-actin(>1∶40)与AIH-1型患者的血清生化指标和组织学疾病活动度有关，并预示治疗失败概率较高。抗-actin阳性成人患者发病年龄早、糖皮质激素治疗反应较差，肝衰竭病死率和肝移植需求率均高于ANA阳性患者[13]。另外，抗-α-actinin是一种丝状肌动蛋白交联蛋白，存在于42%的AIH患者和66%的抗-actin 阳性AIH患者中[14]。抗-actin和抗-α-actinin同时阳性与急性重型AIH、治疗不完全及复发有关[14-15]。但近年有关抗-actin研究进展的报道较少。G-肌动蛋白则与酒精性肝硬化有关。

2.4 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(抗-SLA) 1987年首次报道了抗-SLA[16]。2000年Wies等[17]应用高滴度SLA抗体血清对cDNA表达文库进行免疫筛选，鉴定出抗-SLA与肝胰抗原(LP)系同一种靶抗原，故将其相应抗体统称为抗-SLA/LP。抗-SLA是一种可溶性胞质蛋白酶，进一步的研究证明该抗原为O-磷酸丝氨酸-tRNA:硒-tRNA-合成酶，位于肝细胞浆内，相对分子质量为50 000。近年有文献[6]已将抗-SLA/LP写法简化为抗-SLA。与其他自身抗体的检测方法不同，指南推荐抗-SLA适宜采用ELISA、免疫印迹法或免疫斑点法等方法检测[19]。基于免疫学新技术的检测方法也已经或者正在进入临床。

在AIH患者中，抗-SLA呈现的突出特点是高特异性和低检出率。它是目前国内外公认唯一对AIH具有诊断特异性的自身抗体，国外报道[2,6,20]抗-SLA出现于AIH的频率为10%～20%，我国一项多中心自身免疫性肝病回顾性调查[1]显示，仅有6%(16/248)的AIH患者抗-SLA阳性。由于该抗体阳性检出率很低，因此，大样本的研究结果极少。笔者团队[21]曾对此抗体作了一项较大样本的回顾性分析，77例抗-SLA阳性病例源于历时9年，自25 200例次肝病患者的血清中收集。这些抗-SLA阳性患者呈现几个特征：(1)90.9%为女性；女性比例高于我国指南[1]中对AIH患者性别分布的描述(男女比例约为1∶4)。初次诊断AIH时平均年龄50岁以上；青少年中无该抗体阳性者。(2)初次诊断时80%以上患者抗体表现为强阳性。(3)抗-SLA与ANA同时阳性70例(90.9%)，无与抗-LKM或抗-LC1同时阳性者。(4)抗-SLA阳性的AIH及AIH/PBC 重叠综合征患者40%(28/70)已进入肝病晚期或终末期，以失代偿肝硬化及慢加急性肝衰竭为主。因此，鉴于抗-SLA对AIH诊断的高度特异性，对于不明原因肝病患者应送检抗-SLA，以明确AIH的诊断。另一项大样本结果源自2019年一项欧洲多国家多中心研究[22]，89例抗-SLA阳性和230例抗-SLA阴性的AIH患者在临床表现及病理特征上是相似的；但是抗-SLA阳性的患者可能需要更长期的免疫抑制剂治疗。

Chen等[23]对包括美国、德国、日本在内的8个研究中心的1297例 AIH 患者进行Meta分析发现，与抗-SLA阴性患者相比，阳性患者的肝脏死亡风险增加3倍以上，治疗复发风险增加近2倍。有报道[24]认为抗-Ro52常与抗-SLA同时存在，推测抗-SLA对疾病的不良结局可能与抗-Ro52同时存在相关。但迄今为止，SLA在AIH发病机制中的作用尚不清楚。

2.5 抗肝肾微粒体(抗-LKM)和抗肝细胞溶质抗原抗体-1(抗-LC1)

2.5.1 抗-LKM 分为3个亚型，通常以IIF法检测抗-LKM总抗体，用免疫印迹法、ELISA及其他免疫学方法检测抗-LKM-1型抗体。抗-LKM(包括抗-LKM-1)和抗-LC1是AIH-2型的诊断标志，通常在ANA和ASMA阴性的情况下被检测到。不同于以成年患者为主的AIH-1型，2型患者多见于青少年及儿童。AIH-2型患者很少见，仅占总AIH的3%～ 4%，且在不同地区不同人群中差异较大。北美成人中抗-LKM-1对AIH的敏感度较低(1%)，而在英国和加拿大，13%～38%的儿童AIH患者中可以检测到抗-LKM-1[3]。

抗-LKM-1的靶抗原为细胞色素P4502D6，是较早被认识的AIH的靶抗原，并且有研究[25]证实在AIH患者肝脏内有针对该自身抗原的CD4+和CD8+T淋巴细胞的存在。Gordon等[26]报道抗-LKM-1阳性的AIH患者比阴性患者的病情更严重。

2.5.2 抗-LC1 该抗体所识别的靶抗原是亚氨甲基转移酶-环化脱氨酶，在10%的AIH-2型患者中抗-LC1是唯一可检测到的自身抗体，其与AIH的疾病活动度和进展有关[3]。但该抗体临床十分罕见，也鲜见报道。

抗-LKM-1和抗-LC1具有较高的AIH诊断特异性。但是，它们也存在于其他肝病中。笔者在多年临床样本中发现，抗-LKM和抗-LC1在丙型肝炎、乙型肝炎及药物性肝损伤中也会出现。韩莹等[27]报道北京佑安医院十几年积累的15例抗-LKM阳性病例，其中7例诊断为AIH，8例因HCV RNA阳性而诊断为丙型肝炎。笔者团队曾诊疗1例反复肝功能异常伴有抗-LKM阳性儿童，初诊时临床和病理均诊断为药物性肝损伤，经糖皮质激素反复治疗后再次肝活检，病理符合药物诱导的AIH。由此提示，对抗-LKM阳性的儿童排除AIH诊断时需要谨慎。

2.6 AIH相关的其他自身抗体

2.6.1 抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA) ANCA尤其是非典型ANCA(pANCA)的存在，在缺乏其他自身抗体的情况下可提示AIH的诊断。由于它与PSC和炎症性肠病也有关，这些疾病必须加以排除。

2.6.2 抗去唾液酸糖蛋白受体抗体(anti-asiaglycoprotein receptor, 抗-ASGPR) 抗-ASGPR是肝脏特异性的自身抗体，在AIH患者中有较高的阳性率。但遗憾的是，它对AIH并非特异性的，在病毒性肝炎等肝病中有一定阳性率，且一直缺乏可靠的商品化试剂，限制了其临床应用。

3 AIH 新标志物的寻找

虽然AIH患者一般可以检测到一种或几种自身抗体，但是缺乏特异性血清标志物是AIH较之PBC诊断困难的主要原因。多年来，许多学者在新标志物的寻找方面做了大量工作，但临床应用的成果并不显著。有报道[28]指出，在1例接受肝移植术后7年出现新发AIH的9岁儿童血清中发现了一种新的肝脏微粒体自身抗体。该儿童出现移植功能障碍伴有转氨酶升高，血清γ球蛋白持续正常。肝组织学和大剂量泼尼松龙加硫唑嘌呤治疗的反应支持新发AIH的诊断。IIF法检测此自身抗体呈现一种新的染色模式(采用基于人类而不是大鼠肝脏蛋白的免疫印迹法)，显示其为一种针对人的细胞色素P4502C19抗原的新的肝脏微粒体自身抗体。

德国学者Engel等在2019年EASL和IAIHG会议上报告了一种AIH诊断相关自身抗体：抗亨廷顿相互作用蛋白-1相关蛋白(anti-Huntington interacting protein-1 related protein，抗-HIR-1 RP)。在单中心研究呈现较好结果的基础上，该作者已在欧洲多个国家开展了多中心研究，结果表明该自身抗体诊断AIH的特异性优于ANA和ASMA，敏感性优于抗-SLA和抗-LKM。如果抗-HIR-1 RP与ANA、ASMA三种抗体联合检测，可明显提高AIH的诊断敏感性，特别是对于未治疗的AIH患者，该自身抗体有更高的诊断价值。

4 总结与展望

尽管AIH的发病机制和诊断治疗研究近年来取得了长足的进步，但依然面临诸多问题和挑战。AIH的诊断较为复杂，是排除诊断基础上的综合诊断，缺乏特异性诊断标志物是AIH确诊困难的主要问题。随着免疫学、分子生物学等技术的迅速发展，期待有新的标志物被发现，对诊断或发病机制的认识更有帮助。在传统的检测方法基础上，自身抗体的检测技术也在不断进展，期待其自动化、标准化的发展方向将为临床提供更准确、更便于解读的方法，提高疾病的诊断和治疗水平。