外泌体在非肿瘤性肝脏疾病中的研究进展

徐 帅， 张立平

1 北京中医药大学东方医院 消化科， 北京 100078； 2 北京中医药大学， 北京 100029

外泌体产生于细胞中的多泡体，携带多种参与细胞内信号转导的蛋白质、核酸、脂质等，可通过细胞膜受体直接激活受体细胞介导细胞间信息交流和调节细胞微环境，参与细胞生长、增殖，肿瘤发生和侵袭，抗病毒感染和细胞再生等病理生理过程。越来越多的研究表明，外泌体在肝脏疾病发生发展过程中具有重要作用。本文就外泌体与非肿瘤性肝脏疾病诊疗相关的最新研究进行综述，以期为临床诊治提供新的思路。

1 外泌体的基本特性

外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡之一，1983年首次由Pan和Johnstone发现于成熟的哺乳动物网织红细胞中[1]。外泌体为脂质双分子层架构，直径为30～100 nm，密度为1.1～1.2 g/ml，电镜下呈杯状或球形，其大小、形状和密度等受特定的蛋白质、脂质、酶和矿物质含量的影响，且在不同的囊泡之间存在较大差异[2]。外泌体主要来源于细胞内多囊泡体(multivesicular bodies，MVBs)，MVBs可以通过与溶酶体融合或与细胞膜融合而降解，其内容物被分泌出细胞膜[3]。外泌体可存在于人体多种体液中，如血液、尿液、唾液、羊水、母乳、胸水、腹水、胆汁等，大多数细胞如间充质干细胞、免疫细胞、神经细胞、心肌细胞、内皮细胞等都可以产生并释放外泌体。

外泌体富含各种蛋白质、脂质、DNA和RNA，参与人体多种生命活动[4]。最常见的蛋白质是四聚体蛋白(CD9、CD82、 CD81、CD63)，其中CD63和CD81是最为常用的特异性标志物。还富含与膜转运和融合相关的蛋白(如GTPases)，MVB合成相关蛋白(如Alix、TSG101)，热休克蛋白(如HSC70、HSC90)等[5]。最外层为附着于表面蛋白和某些外小叶脂质的糖基冠层，糖基冠层下面的外泌体膜含有胆固醇、神经酰胺、鞘磷脂、糖磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酸等脂质[6]。外泌体中的核酸包括mRNA、microRNA(miRNA)、长链非编码 RNA等，近年来，单链DNA和线粒体DNA也被证实存在于外泌体中[7]。

外泌体常用的提取方法有超速离心技术、尺寸排阻色谱法、超滤分离法、免疫亲和捕获方法、聚合物沉淀、微流体芯片分离技术[8]，由于每项技术都具有明显的优缺点，目前仍没有一种方法能作为金标准。近年来，研究者[9]开发出针对不同样本的商用外泌体提取试剂盒，能够避免复杂的操作步骤和取得更高的纯度和回收率。外泌体的具体功能与其所来源的细胞类型有关。在早期，人们认为外泌体主要起着处理细胞垃圾的作用，20世纪末才发现外泌体具有免疫调节和细胞间通讯的作用。他们参与免疫应答、细胞增殖、炎症、凝血、泌乳和维持神经功能等正常生理过程，同时还在肝脏疾病、神经退行性疾病、癌症以及移植物排斥反应等过程中发挥作用[10]。同时由于外泌体具有较小的分子结构、天然的分子转运特性和良好的生物相容性，作为药物递送载体具有广阔应用空间[11]。

2 外泌体与肝脏疾病的相关性

2.1 外泌体与病毒性肝炎 病毒性肝炎是严重影响人类健康的公共卫生问题，主要以HBV和HCV感染为主。慢性病毒性肝炎反复迁延，可导致肝纤维化，并逐步进展为肝硬化和肝细胞癌。外泌体可通过转运病毒相关分子促进细胞间的病毒感染，亦可通过细胞间的通信作用参与病毒感染后的免疫调控和抗病毒过程。

研究[12]表明HBV通过外泌体进入自然杀伤细胞(NK细胞)，抑制视黄酸诱导基因I的表达，并使NF-κB和p38信号通路失活而诱导NK细胞功能障碍。HBV感染肝细胞后，外泌体中免疫调节的miRNA水平升高，同时他们被转移到巨噬细胞中，继而抑制巨噬细胞中IL-12p35 mRNA的表达，抵抗宿主的先天免疫应答[13]。干扰素诱导的跨膜蛋白(interferon-induced transmembrane protein 2，IFITM2)是HBV宿主抗病毒治疗的负调控因子，其作用于I型干扰素信号的上游，外泌体介导IFITM2从肝细胞到树突状细胞的转运增强了IFITM2对内源性干扰素α合成的抑制作用，从而阻断了外源性干扰素α的抗HBV作用[14]。

Karamichali等[15]发现外泌体能够通过介导框内缺失突变体的转移来调节HCV病毒复制并使病毒持续感染。HCV外泌体携带的miR-19a可以靶向肝星状细胞(HSC)中细胞因子信号传导3的抑制因子，导致信号传导及转录激活蛋白3介导的TGFβ信号传导激活，使促纤维化标志物高表达以及增强炎症反应[16]。研究[17]发现HCV包膜糖蛋白E2可通过外泌体途径释放到细胞外且该过程受到syntenin蛋白的调控，E2包被的外泌体能够帮助病毒逃逸抗体的中和。这些结果表明外泌体在病毒性肝炎的病毒传播中起着重要作用，并且破坏宿主的先天免疫反应，使病毒持续感染，因此外泌体可作为病毒性肝炎潜在的分子标志物和治疗手段。

2.2 外泌体与酒精性、非酒精性脂肪性肝病 肝脏是人体代谢的重要器官，在脂肪的消化、吸收、氧化、分解、合成和运输中起着关键作用。在酒精性肝病(ALD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的肝损伤进展过程中，炎症、血管生成失调和纤维化是关键环节，且相互之间密切相关。

研究[18]显示ALD小鼠循环外泌体数量增加，接受ALD诱导外泌体的小鼠TNF、IL和单核细胞增多，而CD206、CD163比例下降，同时能够激活HSP90从而诱导巨噬细胞活化。实验[19-20]表明，对miR-155基因敲除小鼠进行酒精诱导，其肝脏脂肪变性、血浆ALT水平、氧化应激反应、自噬相关通路和蛋白明显低于对照组小鼠，人体肝活检亦表明ALD患者肝组织中miR-155的表达显著增加。

NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏表现，脂毒性在其发展中具有重要作用，脂肪沉积是主要的病理特征。研究[21]发现非酒精性脂肪性肝炎(NASH)实验模型中，从受损/应激肝细胞中释放的肝细胞来源的细胞外囊泡通过激活肝内皮细胞、HSC、肝巨噬细胞等促进肝脏疾病的进展。巨噬细胞的M1促炎表型是NAFLD进展中的重要过程，研究[22]发现NAFLD患者的血清miR-192-5p水平与肝炎性活动评分和疾病进展呈正相关；NAFLD大鼠模型中，脂毒性肝细胞释放出比对照组更多的富含miR-192-5p的外泌体，诱导M1巨噬细胞(CD11b+/CD86+)活化并增加诱导型一氧化氮合酶、IL-6和TNFα的表达，诱导脂肪变性的肝脏发生炎症损伤。

2.3 外泌体与肝纤维化 肝纤维化是由很多因素引起的慢性肝损伤的伤口愈合反应，HSC活化是导致肝纤维化的主要原因。研究[23]发现有氧糖酵解对于将静息HSC重编程为活化的HSC至关重要，来自缺氧诱导因子1介导的活性HSC分泌外泌体，传递特异性糖酵解相关蛋白GLUT1和PKM2，它们在活化HSC的衍生外泌体中表达增加，并诱导静止的HSC产生Warburg效应。外泌体释放被阻断时，HSC的激活和糖酵解被抑制，提示外泌体可能通过调节糖酵解影响肝脏非实质细胞之间的代谢转换。对自噬与肝纤维化的研究[24]发现，应激升高的TRIB3与SQSTM1相互作用，干扰SQSTM1在肝实质细胞中的功能并激活HSC而促进肝纤维化，因此靶向TRIB3-SQSTM1相互作用也为治疗纤维增生性肝病提供了新思路。外泌体RNA在HSC活化过程中也发挥重要作用。研究[25]发现含miR-192的外泌体数量通过HCV复制而增加，它们从病毒复制的肝细胞中释放出来，然后被传递到HSC中，激活和诱导细胞分化，同时促进人原发性肝干细胞向肌成纤维细胞的转化。肝细胞外泌体MALAT1通过miR-26b参与亚砷酸盐诱导的纤维化过程中HSC的活化[26]。肝纤维化还受到结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CCN2)的控制，体内研究[27]表明，来源于原代小鼠活化 HSC的外泌体中CCN2 增加，利用从活化 HSC中分离的外泌体孵育静态 HSC，可促进CCN2 和α平滑肌肌动蛋白的高表达。另有体外实验[28]表明，胆管细胞来源的外泌体H19通过促进HSC活化和增殖，在胆汁淤积性肝纤维化进展中发挥作用，无论是小鼠胆汁淤积性肝损伤模型，还是原发性硬化性胆管炎和原发性胆汁性胆管炎患者，血清外泌体H19水平与肝纤维化严重程度相关。

2.4 外泌体与肝损伤 肝损伤可由多种理化及生物因素导致，可出现多种肝脏疾病的临床表现，个体之间发病时间差异较大。由于我国人口基数庞大，各地医疗水平发展不均，部分地区存在用药不当以及人们对药物安全性问题的认知不够，药物性肝损伤(DILI)发病率呈现逐年升高的趋势，严重者可导致急性肝衰竭。因此对肝损伤进行早期诊断、控制病情进展、减少肝衰竭发生是至关重要的。

研究[29]发现，巨噬细胞释放的脂多糖(LPS)诱导的外泌体通过调节核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体通路的激活参与脓毒症导致的急性肝损伤过程，与正常对照组相比，注射LPS外泌体的小鼠ALT、AST和乳酸脱氢酶水平升高，肝脏有大范围的炎症细胞浸润。在对乙酰氨基酚(APAP)所致肝损伤小鼠的研究[30]中发现，实验组小鼠外泌体肝特异性蛋白精氨酸酶-1水平高于对照组，且APAP衍生的外泌体提高了与细胞毒性相关的mRNA转录的表达，激活激酶介导的原代肝细胞和各种肝癌细胞的细胞死亡信号，导致肝细胞增殖减少。另一项关于APAP诱导肝损伤的研究[31]表明，外泌体miR-122a-5p、miR-192-5p、miR-193a-3p和miR-194-5p的表达水平在肝组织中显著下调，而在血清中同时上调，这可能是由于肝损伤导致miRNA释放到循环中，同时miRNA-193a-3p在给药后12 h即显著升高。在氯吡格雷处理的HepG2细胞中分别观察到miR-26a-5p的上调和miR-15b-5p的下调及其靶mRNAs表达异常，且该变化与血清AST、ALT变化没有相关性[32]。由此可见外泌体miRNA表达的变化或许可作为药物性肝损伤的早期标志物。

3 外泌体作为肝脏疾病诊断和预后的潜在标志物作用

对于肝脏疾病的诊断，早期以血液标志物检测和影像学检查等方法为主，虽具较高诊疗价值，但相对缺乏敏感性和特异性。肝活检作为一种侵入性检查手段具有一定局限性。寻找针对肝脏疾病早期、无创的诊疗方法具有重要意义。外泌体存在于多种体液中，含有反映细胞功能和条件的各种特定类型的蛋白质、核酸等，可作为包括急性和慢性肝病在内的多种疾病的潜在生物标志物，目前已经发现多种miRNA与肝脏疾病有关。

miR-122是目前研究最充分的肝脏特异性miRNA，参与多种肝脏生理病理过程。有报道[33]内源性miR-122的下调可增强HBV复制，而miR-122上调则导致HBV抑制。此外，循环miR-122在慢性乙型肝炎患者中被发现与ALT和HBV DNA水平呈正相关，这意味着循环miR-122水平有可能反映肝损伤和病毒感染的程度，并可能进一步影响抗病毒治疗的预后。通过测定血清miR-122水平的动态变化表明miR-122在第12和24周的变化可能成为核苷(酸)类药物治疗慢性乙型肝炎患者病毒应答的独立预测因子。另有研究[34]发现，ALT水平正常但有严重肝损伤患者的血浆miR-122水平显著高于对照组，同时miR-151a-3p水平明显低于对照组，因此可以提前识别部分正在经历肝损伤但ALT水平正常的患者。

研究[35]发现与早期NAFLD患者相比，晚期NAFLD患者血清中循环外泌体miR-192的水平升高，表明miR-192可能是NASH进展相关的潜在生物标志物。与原发性肝癌患者相比，转移性肝肿瘤中miR-1246和miR-210的表达水平显著升高，因此miR-1246和miR-210可以作为区分肝细胞癌和肝转移瘤的潜在生物标志物[36]。

急性细胞排斥反应是肝移植术后的主要问题，对肝移植术后患者观察发现，半乳糖凝集素9在发生急性细胞排斥反应患者的循环外泌体和切除的肝脏中均表达增高[37]，说明外泌体衍生的半乳糖凝集素9水平可能是肝移植后排斥反应和预后的预测因子。

4 外泌体在肝脏疾病治疗中的作用

外泌体因其可由多种细胞分泌，能够直接转移多种细胞生物活性分子包括mRNAs、miRNA等，已经报道其在纠正代谢缺陷、改善肝功能、促进肝脏再生、预防肿瘤进展等方面对肝脏疾病具有潜在的治疗作用。除直接治疗作用外，外泌体还能够作为载体将特异性生物分子递送至靶细胞发挥其生物学效应。

间充质干细胞移植作为慢性肝病的一种新兴疗法越来越受到人们的关注，外泌体在治疗过程中发挥关键作用。研究[38]表明羊膜来源间充质干细胞来源的外泌体能够显著减少NASH大鼠Kupffer细胞的数量以及TNFα、IL-1β、IL- 6和TGFβ等炎症因子的mRNA表达水平，还显著降低了肝纤维化大鼠的纤维积累、Kupffer细胞数，抑制HSC活化。间充质干细胞外泌体能够减轻肝脏缺血再灌注损伤，实验组炎症标志物、肝组织凋亡标志物caspase-3、bax水平明显低于对照组[39]。肝细胞来源的外泌体能够促进肝细胞增殖和肝再生，而从Kupffer细胞或内皮细胞分离的外泌体则无此作用[40]。另有研究[41]发现，在自身免疫性肝炎实验模型中，NLRP3及caspase-1蛋白的表达增高，骨髓干细胞来源的外泌体具有保护肝损伤的作用，miR-223能够降低NLRP3及caspase-1蛋白的表达，这可能为自身免疫性肝炎的治疗提供一定的方向和依据。脂肪间充质干细胞外泌体通过miR-17靶向硫氧还蛋白相互作用蛋白并抑制异常活化的巨噬细胞及由LPS或TNFα诱导的炎症体激活，而发挥对急性肝衰竭的治疗作用[42]。

CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑技术，对HBV的研究发现转染了CRISPR/Cas9表达质粒的细胞产生的外泌体中存在完整的功能性gRNA和Cas9蛋白，且CRISPR/Cas9系统可通过外泌体传递gRNA和Cas9蛋白至周围的细胞内，发挥其基因编辑功能[43]。这一作用虽然可以避免病毒载体系统本身带来的副作用，但由于外泌体的释放可能通过细胞间通讯影响周围和远端组织或细胞，使得脱靶效应和安全性问题更加复杂化。

5 结语和展望

外泌体作为一种大多数细胞类型产生的细胞外小泡，其介导的细胞间通讯通过将各种生物活性成分从供体细胞转移到靶细胞来调节各种细胞功能，可作为诊断和预后的有效生物标志物，以及药物和基因靶向传递的载体。其在肝脏炎症、肝纤维化、肝硬化及肝衰竭这一系列病理过程中均发挥重要作用。血清外泌体有望作为肝脏疾病的液体活检，代替有创的肝组织活检。尽管外泌体的应用潜力巨大，目前仍存在一定的问题，例如没有标准化的分离方法，常用分离方法存在过程耗时、产量较低、容易污染的问题。另外，关于外泌体的生物发生、释放、靶向及与靶细胞相互作用的确切机制仍需进一步深入探索，才能更好的将其应用于临床和研究当中。