全脱位再植牙牙周组织再生的研究进展

2020-12-20高娟左文王璇

口腔疾病防治 2020年10期

高娟，左文，王璇，2

1. 新疆医科大学第一附属医院（附属口腔医院）儿牙预防科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐（830000）；2. 新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐（830000）

牙外伤是儿童继龋病后就诊口腔科的第二大主诉疾病，也是临床工作的重点和难点之一，其中全脱位牙（completely avulsion teeth，CAT）被认为是最严重的一种。CAT 是指牙齿受到外力撞击时完全脱出牙槽窝，牙周膜韧带撕裂、牙髓组织丧失血供以及牙骨质、牙槽骨造成损伤［1］。CAT 多见于7～14 岁的儿童，上颌中切牙最为好发［2］。目前，对于CAT 临床首选的治疗方法是牙再植术（tooth replantation，TR），该术可恢复牙周膜的血供和营养支持，促进牙周膜再生，从而实现全脱位牙再植成功。然而，TR 受多种因素影响，如患牙是否即刻再植、患牙脱离牙槽窝的时间、患牙保存媒介、牙根发育程度等，把握不当均会导致会导致牙根表面牙周膜坏死，TR 成功率大大降低［3-4］。CAT 再植失败会导致患牙缺失，不仅影响患儿口腔颌面部的生长发育与咀嚼功能，而且影响其发音与美观，对患儿的心理健康发展造成极大的影响。

近年来，关于慢性牙周炎再生牙周组织的研究越来越多，相对于慢性牙周炎的骨质缺损和菌群复杂性而言，TR 是CAT 处于急性创伤期的对症处理，以期实现理想的牙周膜愈合。因此，再生或重建牙周膜是实现CAT 牙周膜愈合的必要条件。能否利用现有的牙周组织再生技术，提高TR 的成功率，减少CAT 对患儿产生的不利影响，是目前国内外学者共同探讨的难题。本文就全脱位再植牙牙周组织再生的研究进展作一综述。

1 种子细胞

1.1 牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）

牙周膜（periodontal ligament，PDL）是围绕牙根并连接牙根与牙槽骨的致密结缔组织。牙周膜细胞（periodontal ligament cells，PDLs）包括成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞以及未分化的间充质细胞。其中最常见的是成纤维细胞，其主要功能是合成胶原、吞噬经酶的水解而降解的旧胶原纤维，并具有牙周组织再生修复作用。Seo 等［5］2004 年首次提出PDLSCs 的概念，并发现PDLSCs 具有再生潜能。该研究通过克隆筛选和磁珠分离的方法获得成体干细胞克隆株，发现PDLSCs表达间充质干细胞标记物Stro-1 和CD146/MUC18。该实验将PDLSCs 移植到免疫缺陷的大鼠体内，实验表明PDLSCs 可向成牙骨质细胞、脂肪细胞、胶原形成细胞等方向分化，且具有发育成牙骨质-牙周膜样结构的潜能，在牙周组织修复方面有重要的应用价值。Iwasaki等［6］在体外扩增过程中发现随着传代次数增加，PDLSCs 的形态由纺锤体向扁平变宽，且PDLSCs 表现出多种肌成纤维细胞的特征，包括广泛的应力纤维形成、收缩活性和肌成纤维细胞标记物的表达，表明PDLSCs 在体外扩增过程中自发分化向成纤维细胞，为临床提供PDLSCs 培养条件的重要信息。另外，有研究者在PDLSCs 包裹牙齿再植构建的模型中，将新的牙周膜纤维垂直插入新形成的骨组织，牙本质表面观察到新的鞘层形成，与对照组相比牙周组织愈合率较高。有研究探讨了自体PDLSCs 在治疗小型猪牙周炎中的作用，该实验研究将自体PDLSCs 与HA/TCP 组合移植到实验性诱发的小型猪牙周炎骨缺损中，结果显示PDLSCs 介导组中牙槽骨的高度恢复到大约正常水平，而对照组的骨再生非常有限或没有，表明PDLSCs 能够再生牙周组织。

1.2 牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）

DPSCs 是从牙髓组织分离出的一类间充质干细胞，具有自我更新、多向分化潜能和免疫调节功能［7］，可以生成血管、神经以及牙齿软硬组织（包括牙本质、牙髓复合体、牙槽骨等）［8］。Jin 等［9］在DPSCs 和脂肪间充质干细胞骨再生能力对比实验中表明：DPSCs 具有较强的集落形成能力、增殖能力、迁移能力和血管生成潜能。有研究者分离提取DPSCs 后，发现DPSCs 形态特征类似于骨髓间充质干细胞且阳性表达增值相关细胞因子如CD105、CD90、CD70，将DPSCs 回输到有免疫缺陷的小鼠或兔体内时，实验组可形成牙本质-牙髓样复合体，以上实验结果均验证了DPSCs 具有再生能力。

2 相关调节因子

2.1 成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor-2，FGF-2）

FGF-2 是促进伤口愈合和再生的关键细胞因子，研究表明FGF-2 二聚体具有体外活性，可增加创面的肉芽组织和血管密度，改善伤口愈合过程中肉芽组织的形成，促进伤口愈合［9］。Sang-Joun等［10］在建立的犬牙齿全脱位动物模型中，使用FGF-2 溶液（30 μg/0.1 mL）处理后再植，术后4 周和8 周处死动物进行组织学和组织形态学观察，结果显示：在损伤的牙根表面使用FGF-2 可以促进犬牙齿置换后的牙骨质形成，表明FGF-2 有效地促进了损伤的牙周膜和牙骨质的再生。目前研究表明，3～5 ng/mL 的FGF-2 可以促进牙周膜成纤维细胞生长。FGF-2 与骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）对骨/骨形成分化的影响相反，并完全抑制BMP-2 和BMP-4 诱导的矿化，提示FGF-2 作为BMPs 的拮抗剂起主导作用，维持了PDLSCs早期韧带分化的潜能。

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）具有促进干细胞增殖和迁移的潜能，对多种细胞的增殖、迁移和分化具有重要的调节作用。FGF 可以剂量依赖性地调节PDLSCs 的增殖，高浓度的bFGF 可以显著抑制细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。Kang 等［11］证明了bFGF 和BMP-2 的顺序应用可以增加ALP 活性，促进矿物质沉积，上调与成骨相关基因和蛋白质表达，增强PDLSCs 的成骨能力。Xu 等［12］在基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）和bFGF 组合促进骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）介导的牙周膜再生的实验中，设置了CAT 直接植入牙槽窝组，BMSCs 与支架材料材料结合植入牙槽窝组，以及将带有犬BMSCs 的牙齿放入含有SDF-1 和bFGF（以空白培养基为对照）的溶液中放置3～4 d，然后合并牙齿用支架材料将其植入牙槽窝组，micro CT 三维图像显示SDF-1/bFGF组的牙周膜间隙更明显，牙周膜愈合率最高，根吸收率最低，表明SDF-1 和bFGF 结合促进CAT 再植牙牙周膜再生。

2.2 溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）

LPA 是人体内存在的血清生长因子，是一种衍生自磷脂的信号分子，可促进细胞增殖、分化、迁移，具有促/抗炎、促/抗凋亡的作用，对牙周韧带有一定调节作用［13］。Kim 等［14］研究表明10 μmol/L LPA 可以促进PDLSCs 增殖，增强PDLSCs的存活率。有研究表明LPA 通过控制细胞粘附、迁移和分化来增强细胞修复能力。该研究还表明LPA 通过加速损伤组织的修复，将DPSCs 从缺血诱导的凋亡中置换出来，证明LPA 可以促进DPSCs 增殖。另外，亦有报道表明LPA 通过调控牙龈成纤维细胞相关基因调节牙周组织炎症，促进伤口愈合［15］。

2.3 釉基质蛋白（enamel matrix protein，EMPs）

EMPs 是由上皮根鞘分泌的一种可以调控牙齿矿化的细胞外基质蛋白，研究表明，EMPs 可以促进牙周组织再生、降低牙根吸收率［16］。有研究者用含有不同质量浓度EMPs 的无血清培养液培养hPDLSCs，结果显示低于100 mg/L EMPs 可以促进hPDLSCs 的增殖和细胞活性，当EMPs 浓度高于100 mg/L 时则表现为抑制作用。而在PDLSCs 体外创伤愈合模型中，100 mg/L EMPs 实验组创缘完全关闭，优于其他质量浓度实验组和对照组，表明EMPs 可以促进牙周组织再生。研究表明，Ⅰ型胶原蛋白（collagen I，Col-I）和基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）与牙周膜的再生和重塑有关，Zou 等［17］将100 μg/mL 的EMPs 和50 kPa的机械刺激相结合可显著刺激牙周膜成纤维细胞的增殖并提高Col-I 和MMP-1 的表达水平，表明EMPs 在牙周组织再生中具有重要作用。

2.4 白介素-6（interleukin-6，IL-6）

IL-6 是宿主受到若干刺激时产生的多效细胞因子，传递防御信号，刺激急性期反应、免疫反应，调节多种细胞的增殖、分化，参与神经内分泌和免疫系统的稳态调节，在宿主免疫防御中起着非常重要的作用［18］。Liu 等［19］将B 细胞与hPDLSCs 或hBMSCs 共培养，发现上清液中IL-6 的浓度均高于这3 种细胞各自单独培养的浓度。当培养液中IL-6 浓度为0、50、100 和200 ng/ml 时，用抗IL-6 抗体中和IL-6 后对B 细胞增殖无显著影响，而添加抗IL-6 单克隆抗体后，凋亡B 细胞的百分比以浓度依赖性的方式显著增加，表明hPDLSCs 可能通过IL-6 抑制B 细胞凋亡。PD-1 是在活化的T 细胞中发现的抑制共刺激分子，参与机体免疫应答和外周耐受的调节。该实验使用针对PD-1，PD-L1 和PD-L2 的单克隆抗体进行了封闭实验，证明了PDLSCs 通过体外的PD-1 和PD-L1 相互作用抑制了B 细胞的增殖。B 细胞的活化受T 细胞的影响，而T 细胞受hPDLSCs 抑制，异体PDLSC 移植的动物缺乏体液免疫排斥反应。因此，抑制B 细胞功能与抑制T 细胞活化相结合，进一步支持了异体PDLSCs 的使用可能是牙齿再生和牙周膜重建的一种新方法。

2.5 调节性T 细胞（regulatory cells，Tregs）

甘露糖是一种C-2 葡萄糖的表聚物，目前已发现D-甘露糖的T 细胞调节功能，D-甘露糖通过促进转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号传导来刺激Tregs 分化［20-21］。Guo 等［21］将经葡萄糖或甘露糖预处理的PDLSCs 与T 细胞共培养，发现甘露糖预处理的PDLSCs（M-PDLSCs）比葡萄糖预处理的PDLSCs（G-hPDLSCs）对T 细胞增殖的抑制能力更强。与此同时，该研究在T 细胞+M-hpdlscs 共培养体系中发现了更多的Foxp3+T 细胞，Foxp3 是Tregs 最重要的分子标记物，Foxp3+T细胞与Treg 正相关，表明M-hPDLSCs 诱导更多的T细胞分化为Tregs。该研究组筛选了不同的细胞因子发现：T 细胞+ M-hPDLSC 共培养体系中IL-6 明显较低，故将T 细胞+ G-hPDLSCs/T + MhPDLSC 混合细胞回植裸鼠体内，结果表明D-甘露糖通过抑制hPDLSCs 中的IL-6 诱导产生更多的Tregs。IL-6在调节Treg/Th17 平衡中起着非常重要的作用。Tregs 介导免疫耐受，Th17 介导炎症反应，二者相互拮抗，保持机体免疫动态平衡。此外，Treg 被激活之后，可以抑制B 细胞，杀伤细胞以及其他免疫细胞。当机体处于感染状态时，Treg 通过调节杀伤病原体的T 细胞和引起过度炎症反应的T 细胞之间的平衡发挥作用，该研究发现了d-甘露糖和IL-6 在hPDLSC 免疫调节中的新功能，为PDLSCs 再生牙周组织提供新的可能。

3 支架材料的应用

支架材料通常作为细胞的载体，为细胞的生长、增殖、分化提供一个良好的微环境。理想的支架材料应满足：生物相容性，生物降解性和类似于细胞自然环境的三维结构。目前支架材料广泛应用于牙周组织再生，为细胞黏附和增殖提供了三维生长空间［22］。

3.1 自体生物材料

有研究者分离犬PDLSCs，并将牙根作为携带PDLSCs 的支架，根据是否涂布纤维连接蛋白和（或）磷酸钙表面涂层分组，研究表明：纤维连接蛋白和（或）磷酸钙增加了PDLSCs 在牙根表面的黏附，可以促进PDLSCs 黏附在牙根表面产生新的牙周附着体。

富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是一种富含细胞因子和生长因子的自体生物材料。Yang 等［23］在犬CAT 再植时采用富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）浸泡，表明PRP 的应用可以减轻牙固连，增加牙周膜样和牙骨质样组织的形成。Du 等［24］在大鼠牙周组织骨缺损模型中，设置黏骨膜瓣覆盖缺损的对照组，PRF 组和PRF/阿司匹林复合物实验组进行研究，结果表明：PRF/阿司匹林复合物可为增强间充质干细胞的黏附和生存能力提供适宜的理化微环境，并在移植早期通过抗炎药物保护间充质干细胞不受宿主免疫系统的影响。PRF 和PRF/阿司匹林复合物均能促进大鼠牙周组织再生，但PRF/阿司匹林复合物的作用比PRF 更明显，为促进牙周组织再生提供了新的理论依据，为CAT 再植提供了新的思路。

3.2 人工合成材料

3.2.1 纳米支架材料 HydroMatrix（HydM）是近年来开发用于细胞培养的新型可注射肽纳米纤维水凝胶。Nagy 等［25］将PDLSCs 接种在未涂布或涂有HydM 的表面上，生长阻抗测定和细胞活力测定都表明PDLSCs 能够在HydM 上粘附和增殖；ALP 活性和von Kossa 染色证明PDLSCs 可以在HydM 凝胶上黏附、迁移、存活、增殖和分化成骨，表明HydM是PDLSCs 再生应用可利用的材料。有学者将培养的PDLSCs 诱导成骨并附着在双相磷酸钙支架上，然后将附着有PDLSCs 的支架材料移植到犬体内。结果显示：附着有PDLSCs 的支架材料可促进新生骨形成和新生胶原纤维以直角插入邻近牙骨质和骨，且再生组织有丰富的血管生成，表明PDLSCs 结合支架材料是牙周组织再生方法中非常有应用前景的方法。

3.2.2 Bio-Oss 颗粒有研究者构建犬牙周炎骨缺损模型，对照组植入Bio-Oss 颗粒，而实验组则植入等量的载有P3DPSCs 的Bio-Oss 颗粒，结果表明：两组均有新牙骨质，牙周膜和骨组织的形成，实验组再生牙骨质比对照组的厚，覆盖了较大的根部表面，而对照组骨质较少且分散，表明DPSCs 结合生物材料能够再生牙周组织修复牙周缺损。