肥大细胞特异性受体介导神经源性炎症和疼痛

1.研究背景

肥大细胞是炎症反应过程中的关键效应细胞之一，是连接神经系统和免疫系统的重要纽带，参与了术后疼痛、关节炎等多种病理过程。肥大细胞相对于其他天然免疫细胞具有显著的空间优势，可以更加靠近周围神经末梢的地方，是最先对感觉神经纤维激活做出反应的细胞之一。通过神经肽激活后的肥大细胞可以释放多种“促炎细胞因子”和“趋化因子”，参与招募多种天然免疫细胞，进一步促进炎症级联反应和外周感觉传入的致敏。Mrgprs是一类G-蛋白偶联受体，主要在外周感觉神经元上，在疼痛和瘙痒形成中扮演重要作用；Mrgprb2 (Mas-related G-protein coupled receptor member B2)

作为该家族中的一员，选择性地表达在结缔组织中的肥大细胞上，能够被多种基础促分泌物激活；Mrgprb2 基因敲除并不影响经典的IgE 激活的肥大细胞信号传导，许多肽能药物激活Mrgprb2 后引起肥大细胞促炎因子释放，产生炎性反应和疼痛。作者在该研究中就Mrgprb2 参与炎性诱导反应、促进免疫细胞招募以及多肽类物质（包括P 物质）激活Mrgprb2 诱导肥大细胞释放细胞因子和趋化因子的机制等问题进行了研究。

2.研究结果

（1）在炎性疼痛模型中，Mrgprb2-/-小鼠表现出对炎症诱导的超敏反应降低

在手术切口损伤小鼠模型中，Mrgprb2 基因敲除 (Mrgprb2-/-) 小鼠与野生型小鼠 (WT) 相比，术后24 h后其热痛觉和机械痛敏感性以及损伤部位肿胀程度均明显减少；用白喉毒素 (DTX) 处理Mrgprb2Cre/DTX小鼠选择性剔除Mrgprb2+阳性肥大细胞后，小鼠在机械痛和热痛觉过敏反应上均明显低于野生小鼠；以转录激活因子 (ATF3) 在背根神经节(DRG) L4和L5的激活情况作为DRG 神经损伤的标志观察手术对神经损伤的影响，在手术后24 h，Mrgprb2-/-小鼠比WT 小鼠神经损伤程度明显降低；说明Mrgprb2 参与了术后导致的痛觉过敏。

（2）在术后炎症和疼痛模型中，肥大细胞上的Mrgprb2 受体参与了免疫细胞的招募

为了便于观察肥大细胞的分布特性，使用Mrgprb2cre小鼠与tdTomato 报告基因小鼠交配获得的BAC 子代小鼠，子代小鼠中的肥大细胞被荧光标记，比较了WT 小鼠和BAC 小鼠术后24 h 肥大细胞在后脚掌切口部位的积聚情况，结果发现两种小鼠在肥大细胞的数量上无明显区别；另外，为了研究Mrgprb2 是否影响肥大细胞在炎症中参与天然免疫细胞的募集，研究者分析了术后WT 小鼠和Mrgprb2-/-小鼠中CD45+细胞的变化，结果发现Mrgprb2-/-小鼠中CD45+细胞增加的数量明显少于WT 小鼠，在中性粒细胞和单核细胞中也发现了相同的免疫细胞募集现象，说明肥大细胞在招募免疫细胞中起到重要作用，且Mrgprb2 是招募的主要驱动力，并参与了小鼠术后炎性疼痛的调节。

（3）P 物质通过激活Mrgprb2 促进天然免疫细胞的募集

临床上，手术后P 物质水平会伴随急性疼痛强度增加而升高，有研究表明P 物质是Mrgprb2 的内源性激动剂。为了研究P 物质对天然免疫细胞招募的影响，研究者选择了Mrgprb2-/-小鼠、NK-1R 基因敲除(NK-1R-/-) 小鼠和WT 小鼠，比较了在后脚掌注射P 物质后天然免疫细胞招募的情况。结果发现：P 物质注射24 h 后，Mrgprb2-/-小鼠中CD45+细胞、中性粒细胞、单核细胞明显少于WT 小鼠，而NK-1R-/-小鼠和WT 小鼠中的这几类免疫细胞数量几乎没有变化。说明P 物质诱导天然免疫细胞（包括CD45+细胞、中性粒细胞、单核细胞）招募与Mrgprb2 密切相关，而与P 物质的经典受体（神经激肽受体-1，NK-1R）无关。为了澄清P 物质诱导天然免疫细胞招募在两款基因敲除小鼠 (Mrgprb2-/-andNK-1R-/-) 存在差异的原因，又使用NK-1R GFP小鼠检查了NK-1R 的分布特点，结合RT-PCR 分析，发现与特异性表达在肥大细胞上的Mrgprb2 不同，NK-1R 特异性表达在脊髓而不表达于肥大细胞或初级感觉神经元；术前注射P 物质抗体可以逆转术后损伤引起的天然免疫细胞募集以及损伤部位的肿胀，即阻止P 物质的释放可以缓解术后的炎症和疼痛的程度；因此，研究者提出P 物质通过激活Mrgprb2 而非NK-1R 来促进天然免疫细胞的募集，参与和调节术后的炎症和疼痛。

（4）P 物质通过激活人类肥大细胞上MRGPRX2 受体释放炎性细胞因子和趋化因子

人类肥大细胞上MRGPRX2 基因与小鼠的Mrgprb2 基因是同源基因，为了验证人类肥大细胞上MRGPRX2 基因的功能，研究者选用了人肥大细胞系—LAD2 细胞，研究了P 物质对LAD2 细胞的影响，P 物质处理后检测收集到的上清液，通过检测人类常见的细胞因子和趋化因子后（细胞因子：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17A、IFN-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF) 等；趋化因子：CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL10、CXCL11、CXCL9、嗜酸性粒细胞趋化因子、CCL17、CCL22 和CXCL1 等），发现P 物质刺激后仅诱导炎性细胞因子TNF-α、GM-CSF 和IL-8 的表达以及趋化因子CCL2、CCL3 和CCL4 的升高；在MRGPRX2 基因敲除的LAD2 细胞中，上述6 种细胞因子和趋化因子的增量均显著降低；以观察到P 物质诱导的增量最大的趋化因子CCL2 和CCL3为标准，在术后模型和P 物质诱导的模型中，发现Mrgprb2-/-小鼠的CCL2、CCL3 释放量明显低于WT小鼠；进一步用强效NK-1R 拮抗剂SR140333 预处理LAD2 肥大细胞，发现P 物质诱导的肥大细胞释放的炎性细胞因子和趋化因子含量没有显著改变，说明P物质激活人类肥大细胞释放炎性细胞因子和趋化因子是通过MRGPRX2 而非NK-1R。

3.讨论

作者在此研究中提出肥大细胞特异性受体Mrgprb2 是神经肽诱导免疫细胞募集的关键驱动因子。尽管术后损伤模型在TRP 通道表达和传入神经激活方面与CFA 模型不同，但其更强的临床相关性，适合作为疼痛机理研究的主要模型。使用术后损伤模型进行研究后，发现与CFA 模型中一致，Mrgprb2-/-小鼠的机械痛觉和热痛觉过敏现象均降低，表明损伤引起炎症后激活Mrgprb2+阳性肥大细胞都有类似的机制。

将Mrgprb2cre小鼠与tdTomato 报告基因小鼠交配获得的BAC 子代小鼠与WT 小鼠在术后24 h 相比较，结果发现两种动物在损伤部位肥大细胞的数量上无显著差异，说明这两款小鼠在术后损伤炎性痛过程中与肥大细胞的数量无关。然而，作者观察到术后损伤后，Mrgprb2-/-小鼠损伤部位肥大细胞数量的增量明显低于WT 小鼠，且肥大细胞数量上升现象在24 h 后又消失，提示Mrgprb2 与肥大细胞的迁徙密切相关，并且此种迁移并非由IgE 介导，但导致损伤部位肥大细胞局部增生的原因还需要进一步研究。除肥大细胞外，Mrgprb2 对其他免疫细胞的募集也有影响，作者研究了WT 小鼠与Mrgprb2-/-小鼠术前和术后CD45+细胞、中性粒细胞和单核细胞数量的变化，结果发现这两种小鼠术前的这些免疫细胞没有显著区别，然而术后损伤，Mrgprb2-/-小鼠损伤部位免疫细胞数量的增量明显低于WT 小鼠。由于中性粒细胞、骨髓细胞中的单核细胞参与了免疫细胞的募集和术后引起的炎症疼痛，如果Mrgprb2 促进单核细胞募集是术后损伤炎性痛的主要驱动力，则需要进一步研究损伤后Mrgprb2 参与中性粒细胞在募集中的作用。然而，作者观察到Mrgprb2-/-小鼠术后损伤Mrgprb2 介导两种细胞的募集均减少，说明在组织损伤反应中，Mrgprb2 是免疫细胞募集的关键因子。

P 物质在疼痛和炎症中起到的作用推动了过去三十年内多种NK-1R 相关药品的研发，但是NK-1R拮抗剂在多种临床试验情况下均未显示镇痛效果。作者发现NK-1R-/-小鼠的免疫细胞募集并没有减少，说明P 物质诱导的免疫细胞募集过程与其经典受体NK-1R 无关。此外，阻断P 物质释放后由术后损伤引起的机械痛觉和热痛觉过敏以及免疫细胞募集得以减轻，进一步证实了P 物质直接参与术后损伤引起的炎性痛。该研究表明Mrgprb2/MRGPRX2 是P物质诱导的天然免疫细胞募集的基础，可能为未来镇痛药物研发提供一个新靶点。

作者还研究了P 物质激活肥大细胞上的Mrgprb2 受体引起免疫细胞募集的机制。在人的LAD2 肥大细胞中，P 物质激活MRGPRX2 受体（小鼠同源基因Mrgprb2）可引起三种炎性细胞因子（TNF-α、GM-CSF 和IL-8）显著增加。肥大细胞TNF-α 的释放也被证明是产生趋化因子GM-CSF 和IL-8 的一个自分泌正反馈信号；GM-CSF 除了是单核细胞的生长因子以及参与中性粒细胞的募集外，还在关节炎、炎症和疼痛中起作用；IL-8 则是中性粒细胞的趋化因子，当其被注射到小鼠后脚掌时也能引起机械痛觉过敏。对经过P 物质处理的肥大细胞上清液的分析也发现了MRGPRX2 介导的三个趋化因子CCL2、CCL3 和CCL4 的升高。虽然只有少数研究表明CCL2 和CCL3 可直接致敏周围神经元，但它们在单核细胞招募中的作用可能是术后损伤引起炎性痛的主要驱动因素。细胞因子TNF-α、GM-CSF、IL-8 以及趋化因子CCL4 在体内的作用将在未来进一步研究。

此外，阻断NK-1R 后，上述细胞因子和趋化因子的释放并没有减少，证实了MRGPRX2 是它们释放的主要受体。注入P 物质的后脚掌和术后损伤模型的损伤组织中观察到了细胞因子CCL2 和CCL3的释放，而Mrgprb2-/-小鼠中这两种趋化因子释放很少的现象进一步佐证了在LAD2 细胞中MRGPRX2介导细胞因子和趋化因子释放，也证实了损伤后Mrgprb2 在体内免疫细胞募集过程中的重要性。

综上所述，作者在该研究中揭示了肥大细胞上的Mrgprb2 受体是神经肽诱导免疫细胞募集的关键驱动因子，参与了术后小鼠机械痛和热痛觉过敏反应；P 物质通过激活Mrgprb2 受体而不是经典的NK-1R 受体促进免疫细胞募集；小鼠的Mrgprb2 和人类MRGPRX2 是同源基因，分别通过不同肥大细胞参与了手术后的炎性反应和疼痛。因此，该受体功能的发现也将为炎症和疼痛治疗提供一个新的靶点。