热休克蛋白A2、IGFBP-2在胰腺癌患者的表达及与临床病理特征相关性

于洋 薛莹 仓顺东

手术是现阶段临床治疗胰腺癌首选方案，但能进行手术切除者仅占20.0%，且术后5年生存率＜25.0%[1-2]。胰腺癌发病机制基础研究发现，相关调控细胞因子浓度在恶性肿瘤细胞增殖期间出现一定程度改变，可加快癌细胞增殖速度，促进癌细胞浸润或诱导分化[3-4]。热休克蛋白A2（Heat shock protein A2，HSPA2）在精子发育、精卵结合过程中具有重要作用，近年来临床研究发现其在侵袭性肿瘤中呈异常高表达状态，可调控肿瘤增殖、侵袭等[5]。胰岛素样生长因子结合蛋白（Insulin-like growth factor binding protein，IGFBP-2）表达水平异常，能激活癌细胞上游转录因子，加快癌细胞DNA 扩增速度[6]。基于此，本研究探讨分析HSPA2、IGFBP-2 在胰腺癌患者的表达及与临床病理特征相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取本院2015年4月至2019年4月行手术切除的胰腺癌组织标本96例、癌旁正常胰腺组96例、胰腺良性肿瘤组织标本88例作为研究对象。胰腺癌组织标本，男65例，女31例，年龄52～78岁，平均年龄（63.75±4.53）岁；癌旁正常胰腺组织标本，男63例，女33例，年龄50～75岁，平均年龄（63.91±4.85）岁；胰腺良性肿瘤组织标本，男59例，女29例，年龄51～79岁，平均年龄（64.05±4.96）岁；3组基本资料（年龄、性别）均衡可比，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 选取标准

纳入标准：①3组临床资料完整，且知情本研究方案，自愿签署承诺书；②胰腺癌组织标本、癌旁正常胰腺组织标本符合以下标准：均经手术、病理学、细胞学检查证实为胰腺癌；均符合《2016 JPS临床实践指南：胰腺癌》中胰腺癌诊断标准[7]；③胰腺良性肿瘤组织标本：均经手术、病理学证实为胰腺良性病变；肿瘤标志物检测在正常范围内；胰腺组织距手术切缘＞1.0 cm。排除标准：①转移性胰腺癌者；②合并自身免疫性疾病或免疫缺陷者；③肝肾等重要脏器器质性病变者；④既往有放化疗治疗史者；⑤存在胰腺疾病、糖尿病家族史者；⑥精神行为异常者。

1.2 方法

所有标本均经甲醛（40 g/L）固定，常规石蜡包埋。应用石蜡切片技术，甲苯-无水乙醇脱去石蜡，再利用无水乙醇、70.0%乙醇、50.0%乙醇反复洗涤切片，再加入牛奶液体等封闭抗体，封闭5 min，加入预先准备的HSPA2、IGFBP-2蛋白抗体[购自艾博抗（上海）贸易有限公司]，温箱（37℃）条件下，孵育120 min，取出后应用磷酸盐缓冲液（phosphate bufferedsaline，PBS）反复洗涤3次，标本加入荧光标记二抗抗体[购自艾博抗（上海）贸易有限公司]，温箱（37℃）条件下，孵育30 min，再次应用PBS 洗涤，最后采用显色剂（购自南京凯基生物制剂公司）显色、封片，并于显微镜下观察。

1.3 阳性判断方法

随机选取切片中5个高倍视野，其中3分：细胞呈明显棕褐色颗粒；2分：细胞呈棕黄色颗粒；1分：细胞呈淡黄色颗粒；0分：无染色。阳性细胞比率：1分：阳性细胞数目比率≤10.0%；2分：10.0%＜阳性细胞比率≤50.0%；3分：50.0%＜阳性细胞比率≤75.0%；4分：阳性细胞比率＞75.0%。总分=染色深度计分×阳性细胞比率。总分≥3 分为阳性，＜3 分为阴性。

1.5 观察指标

①对比3组HSPA2、IGFBP-2蛋白表达。②分析HSPA2、IGFBP-2蛋白对胰腺癌诊断价值。③对比不同临床病理特征患者胰腺癌组织标本中HSPA2、IGFBP-2蛋白表达。④分析HSPA2、IGFBP-2蛋白表达与胰腺癌患者临床病理特征相关性。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行分析，计数资料用n（%）表示，组间比较采用χ2检验，采用Pearson和Fisher's Exact Test 进行相关性分析，采用ROC曲线分析诊断价值，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组HSPA2、IGFBP-2蛋白表达

胰腺癌组织标本HSPA2、IGFBP-2蛋白阳性表达率高于胰腺良性肿瘤组织标本、癌旁正常胰腺组织标本，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

2.2 HSPA2、IGFBP-2蛋白对胰腺癌诊断价值

ROC曲线分析，两者联合诊断AUC为0.800，大于HSPA2（0.689）、IGFBP-2（0.740），诊断敏感性93.75%，诊断特异性66.30%，见表2、图4。

2.3 不同临床病理特征患者胰腺癌组织标本中HSPA2、IGFBP-2蛋白表达

TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴结转移的胰腺癌组织标本中HSPA2、IGFBP-2蛋白阳性表达率高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表1 3组HSPA2、IGFBP-2蛋白表达[n（%）]Table1 Expression of HspA2 and IGFBP-2 in three groups[n（%）]

图1 胰腺癌、胰腺癌癌旁正常胰腺组织及胰腺良性肿瘤病理图（×400）Figure1 pathology of pancreatic cancer，normal pancreatic tissue beside pancreatic cancer and benign pancreatic tumor（×400）

表2 HSPA2、IGFBP-2蛋白对胰腺癌诊断价值[n（%）]Table2 diagnostic value of HspA2 and IGFBP-2 protein in pancreatic cancer[n（%）]

图4 ROC曲线Figure4 ROC curve

2.4 HSPA2、IGFBP-2蛋白表达与胰腺癌患者临床病理特征相关性

经Pearson 相关系数分析，HSPA2、IGFBP-2蛋白表达与胰腺癌患者TNM 分期、淋巴结转移呈正相关，与分化程度呈负相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

3 讨论

胰腺癌早期症状具有隐匿性，多数患者确诊时已处于中晚期，丧失手术最佳治疗时机，且数据统计，胰腺癌治疗后无瘤生存期＜2年，且治疗后病死率持续性维持在45%～60%[8]。因此及时鉴别诊断胰腺癌，探究影响患者预后相关因素，对延长患者生存期具有重要意义。

Scieglinska D 等[9]研究发现HSPA2 在肺癌、膀胱癌、宫颈癌的组织标本、细胞株内呈高表达状态，推测HSPA2 在肿瘤发生、发展中可能扮演重要角色。本研究结果显示，HSPA2 蛋白阳性表达率在胰腺癌组织标本中过度表达。吴杨等[10]研究通过检测对比15例胰腺癌、癌旁胰腺组织标本，证实HSPA2 在胰腺癌组织中翻译、转录水平均明显高于癌旁胰腺组织，充分证明HSPA2 过度表达参与胰腺癌的发生、进展。文献分析，胰腺癌癌细胞无限增殖过程中，需大量HSPA2 维持稳定，且肿瘤所致应激环境一定程度也诱导HSPA2 过度表达[11]。同时，相关研究显示，HSPA2 在多种侵袭性肿瘤中呈较高水平表达，HSPA2基因沉默可大幅度降低肿瘤细胞增殖、侵袭及移植瘤生长能力[12]。本研究数据表明，HSPA2 蛋白阳性表达率在TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴结转移的胰腺癌组织标本中异常表达。姜波等[13]研究通过检测对比30例食管癌患者也发现，热休克蛋白水平阳性率高表达与肿瘤细胞分化、淋巴结转移、TNM 分期等因素相关，可见通过检测HSPA2 蛋白表达水平，能指导临床评估病情进展。

表3 不同临床病理特征患者胰腺癌组织标本中HSPA2、IGFBP-2蛋白表达[n（%）]Table3 HSPA2、IGFBP-2 protein expression in pancreatic cancer tissues of patients with different clinicopathological characteristics[n（%）]

表4 HSPA2、IGFBP-2蛋白表达与胰腺癌患者临床病理特征相关性Table4 Correlation between HspA2，IGFBP-2 protein expression and clinicopathological characteristics of pancreatic cancer patients

IGFBP-2 作为生长因子家族成员，其表达浓度改变可激活癌细胞转录cyc 等上游因子或启动因子[14]。本研究数据表明，IGFBP-2蛋白阳性表达率在胰腺癌组织标本中高表达水平。王悦超等[15]通过73例胰腺癌患者临床病理特征还发现，IG-FBP蛋白表达阳性率平均增高＞25.0%，并在病情进展速度较快或治疗后生存预后较差人群中呈增高趋势。充分说明IGFBP-2蛋白水平在胰腺癌中过度表达，能激活癌细胞内肿瘤相关信号通路NOTCH，提高MAPK 等信号交错式激活风险，影响胰腺癌患者体内肿瘤干细胞特征的维持[16]。本研究进一步经Pearson 相关系数分析发现，IGFBP-2蛋白表达与胰腺癌患者TNM 分期、淋巴结转移呈正相关，与分化程度呈负相关。

综上可知，胰腺癌组织HSPA2、IGFBP-2蛋白高表达，与TNM 分期、淋巴结转移呈正相关，与分化程度呈负相关。监测上述蛋白表达水平，可为临床判断病情发展、评估预后提供科学指导。